dna重組技術(shù)-文庫吧資料
2024-08-17 13:27本頁面
【正文】 合成途徑： 用于 大腸桿菌 的營養(yǎng)標(biāo)記基因常選用色氨酸生物合成基因 trp+用于高等 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 的營養(yǎng)標(biāo)記基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶 基因 tk， 相應(yīng)的受體細(xì)胞則選擇 tk缺陷型dCDP dTDP dTTPTR dTMP dTDP dTTPAPTKAP 氨基喋呤TK 胸腺嘧啶核苷激酶n 胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（ thymidine Kinase,TK） 在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá) , 是嘧啶生物合成補(bǔ)救代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶 , 它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為 dTMP, 繼續(xù)磷酸化生成 dTTP, 參與 DNA的生物合成。 一 微克 pUC18共有 子（ / 2686X660）， 也就是說，每 3400個(gè) pUC18分子才有 一 個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞 另一方面，在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化 一 微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有 2X1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說，每 200個(gè)細(xì)胞只有 一 個(gè)細(xì)胞能接納 pUC18 DNA B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的用途 利用轉(zhuǎn)化率和重組率等參數(shù)可以幫助設(shè)計(jì) DNA重組實(shí)驗(yàn)規(guī)模例如， 某一 DNA重組實(shí)驗(yàn)的重組率為 20%，轉(zhuǎn)化率為 107/mg載體， 經(jīng)切接處理后的載體轉(zhuǎn)化率比天然的載體低 100倍， 欲獲得 104個(gè) 重組克隆，需投入多少載體 DNA進(jìn)行重組實(shí)驗(yàn)？ 若重組率為 100%，則轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生 104個(gè)重組克隆需要： 104 / 107 X 10 2 = mg 載體 DNA 考慮到實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重組率為 20%，所以實(shí)際投入載體應(yīng)為： / 20% = mg 載體 DNA 載體投入量確定后，外源 DNA的投入量即可按 10∶1的要求算出（ 5 mg），甚至還可以估算需要涂布多少塊平板進(jìn)行篩選 B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素 載體及 DNA重組分子方面： 載體本身的性質(zhì) ：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同 載體的空間構(gòu)象 ：質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級 插入片段的大小 ：對質(zhì)粒載體而言，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低 B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素 受體細(xì)胞方面： 受體細(xì)胞必須與載體相匹配，例如： pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM83株，轉(zhuǎn)化率很低；但對大腸桿菌 ED8767株的轉(zhuǎn)化率則較高 B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的影響因素 轉(zhuǎn)化方法方面： 受體細(xì)胞的預(yù)處理 ： 影響最大供受體的比例 ：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 ml 感受態(tài) 細(xì)胞 50 ng DNA 轉(zhuǎn)化方法 ：Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化 106 107 / mg DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 109 個(gè) 原生質(zhì)體 50 ng DNA 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 105 106 / mg DNA lDNA轉(zhuǎn)染 107 108 / mg DNA 電穿孔轉(zhuǎn)化 106 109 / mg DNA C 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增操作 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的擴(kuò)增操作是指轉(zhuǎn)化完成之后細(xì)胞的短時(shí)間培養(yǎng)。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；?DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大 同樣的原理，電穿孔法也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)B 轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率的定義 轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，其定義為：每 微克 載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑 細(xì)菌原生質(zhì)體 的制備：A轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 取 1ml的原生質(zhì)體懸浮液（ 108109個(gè)原生質(zhì)體），加入 10 20 ml DNA重組連接液，同時(shí)加入含有 PEG1000和 Ca2+的等滲溶液，混勻 細(xì)菌原生質(zhì)體 的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌原生質(zhì)體 的再生 ： 原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（ recB， recC， hsdR） （ 具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型） 4. 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 A 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件B 各種基因工程受體的特性大腸桿菌 遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長迅速，培養(yǎng)簡單，重組子穩(wěn)定 適用于外源 DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫的構(gòu)建，是 DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素B 各種基因工程受體的特性枯草桿菌 遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全 ，生長迅速，培養(yǎng)簡單，不產(chǎn)內(nèi)毒素 適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌 遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備B 各種基因工程受體的特性鏈霉菌抗生素的主要生產(chǎn)者，分子遺傳相對操作簡便，不產(chǎn)內(nèi)毒素主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良遺傳不穩(wěn)定，生長相對緩慢B 各種基因工程受體的特性酵母菌 具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)簡單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定
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