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原位雜交與凋亡檢測技術(shù)-wenkub.com

2025-05-10 00:53 本頁面
   

【正文】 (五)、凋亡檢測技術(shù)的應(yīng)用: 某些疾病發(fā)生機理的研究; 腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的研究; 藥物療效的檢測。 甲狀腺癌細(xì)胞核( +), TUNEL 肝組織 TUNEL , AP反應(yīng) 食管鱗癌角化珠凋亡細(xì)胞, TUNEL法。冰凍切片- 20℃ 保存,時間不超過一月。 組織處理: ( 1)新鮮標(biāo)本:人體組織離體后迅速固定,動物實驗可用內(nèi)灌注后處死。 ③ 胞質(zhì)多發(fā)性芽突,芽突脫落 →→ 凋亡小體(胞膜包繞,其中含有不同程度退變的細(xì)胞器和脂滴、核碎片可有可無)。 染色時間:半小時 ~1小時。 ( 2)凋亡小體(嗜酸性小體):被巨噬細(xì) 胞或上皮細(xì)胞吞噬或游離的凋亡細(xì)胞。 ( 1)培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)低速離心( 250r/min)5分鐘,避免破碎。 原位末端標(biāo)記凋亡細(xì)胞:可有或無上述特征(早期觀察)。尤其對初作此項工作的人往往面對失敗而束手無策;但目前國際、國內(nèi)許多公司已推出一系列成套的原位雜交檢測試劑盒,可方便使用。 用上述方法必須是雙酶雙標(biāo),即分別用鹼性磷酸酶和辣根過氧化物酶。二者 結(jié)合起來,形成一個新的分子檢測系統(tǒng), 對于深入研究基因擴增、表達(dá)的調(diào)控與疾 病的發(fā)生機理有廣泛的應(yīng)用前景。 生殖細(xì)胞瘤 16號染色體 ISH HER2熒光原位雜交 皮膚鱗狀上皮細(xì)胞核 HPV DNA( +) ISH 宮頸粘膜 上皮 HPV16( +) ISH 宮頸粘膜上皮 HPV16( +) ISH 宮頸鱗癌 HPV18(+), ISH 鼻咽癌 EBER(+), ISH 腎小管上皮細(xì)胞核 HBVDNA( +), ISH 食管粘膜基底層細(xì)胞質(zhì) Egr1 mRNA( +), ISH 食管鱗癌細(xì)胞質(zhì) Egr1 mRNA( +), ISH 食管鱗癌細(xì)胞質(zhì) CyclinD1mRNA( +), ISH 胃腺癌細(xì)胞質(zhì)端粒酶hTR(+), ISH 肝細(xì)胞癌 CD44V6 mRNA( +), ISH 肝細(xì)胞癌 整合素 a5 mRNA( +), ISH 乳腺癌細(xì)胞質(zhì) PR mRNA(+), ISH 腦星形細(xì)胞瘤 血小板生長因子 mRNA( +), ISH 陽性信號的評定(半定量): ( 1)陽性細(xì)胞數(shù):陽性細(xì)胞 ≤10% 、 ≤30% 、 ≤ 70% 和 70%分別為 4分。 1 DAB顯色: 2030分鐘,充分水洗。 1滴加生物素化羊抗兔 IgG, 370C, 30分鐘。 SSC洗滌 5分鐘 3次。 PBS洗 3次 5分鐘,蒸餾水洗 1次。 用已知確定為陽性或陰性組織進(jìn)行 雜交對照。 將切片用 RNA酶或 DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交。 切片切忌干燥。 蓋玻片周圍加液體石蠟或用橡皮泥封固,以防雜交液蒸發(fā)。 雜交后洗滌。 實驗用玻璃器皿在實驗前一日置高 溫 ( 2400C) 烘烤,以破壞 RNA酶。 固定液: (1) 4%的多聚甲醛(加 1/1000 DEPC) (2) 冰醋酸酒精 (3) Bouin 固定劑 (4) 冰凍切片直接在 (1)液 10min (二)玻片處理:載玻片經(jīng)熱肥皂水刷洗 清潔液浸泡 24h95%酒精浸泡 24 h蒸餾水沖洗 1500C以上烘箱過夜。 四、原位雜交技術(shù)的應(yīng)用: 基因芯片(基因組圖); 基因表達(dá)定位; 轉(zhuǎn)基因檢測。 RNA探針:一般為單鏈;采用體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)(單向或雙向),用新型載體pSP和 pGEM, 在 SP6 RNA或 T7 RNA聚合酶作用下進(jìn)行 RNA轉(zhuǎn)錄而成。 按探針的性質(zhì)分:
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