8第八章原位雜交組織化學-文庫吧資料
2025-02-25 11:19本頁面
【正文】 SSC， SSC， 37℃ 各漂洗 1030min。 11 4 SSC洗脫蓋片，并在同一液中， 37℃ 漂洗 1030min。 ９ 取 10ul含相應(yīng) 探針 的雜交液滴于標本上，如果是 cDNA探 針，則用前將探針于 95℃ 水浴中保溫 10min，馬上冰浴冷 卻，然后再用。 ７ %乙酸酐 10min。 ５ 4%多聚甲醛 PBS固定。 ３ %Trixtion X100 PBS洗 15min。 ? 光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下： １ 石蠟切片脫蠟入水后， PBS洗；冰凍切片直接入 PBS洗。 生物素 聚乙二醇 當歸素（ BPA）：在長波 UV下它可與 DNA堿基共價鍵結(jié)合。 （ 2）按核酸性質(zhì)分類 ① DNA探針 ② cDNA探針 ③ RNA探針 ④ 寡核苷酸探針 （ 3）按染色體上位置分類： ① 重復序列探針 ② 涂染探針 ③ 基因探針及其它 2 探針的標記與應(yīng)用 ? 切口平移法 （ Nick translation） ? 隨機引物法 (Random Primer) ? 末端標記法 ? PCR標記法 ? 體外轉(zhuǎn)錄標記法 不同模板需不同標記方法 生物素標記 cRNA探針 在原位雜交組織化學中的應(yīng)用 1 光敏生物素標記 cRNA探針的應(yīng)用 2 酶促生物素標記 cRNA探針的應(yīng)用 ? 1 光敏生物素標記 cRNA探針的應(yīng)用 光敏生物素標記核酸方法 ， 不需昂貴的酶 ， 只在光照 10～20min， 生物素就結(jié)合在 DNA或 RNA分子上 ， 屬于化學修飾法 ，此方法簡單；成本低；適用于大量制備 （ 50ug） 。而直接標記的信號放大一般受到限制，目前多用 Dupon公司的 TSA系統(tǒng)進行直接標記信號的放大。 ２）間接標記探針 采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。 多因素都將影響 ISHH的實驗結(jié)果。由于同一 RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進行 ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。事先與特異性的 cRNA或 cDNA進行雜交。 ② 可用結(jié)合的免疫組織化學和 ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水 平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相 應(yīng) mRNA共存于同一細胞中。 非放射性核酸探針雜交的細胞或組織： 酶檢測系統(tǒng)顯色 顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。 5 顯示 Visualization 又稱檢測系統(tǒng) Detection system 根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢 測系統(tǒng)進行不同顯色處理。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。 洗滌的條件： 如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。 4 雜交后處理 ? 包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 ? 高嚴格度： 為 Tm1015℃ ，低鹽和高甲酰胺濃度。大約有 70%～ 90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。 甲酰胺和硫酸葡聚糖： （ 4）雜交嚴格度（ Hybridization stringency） 雜交嚴格度： 表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。 雜交時間： 1620h或孵育過夜 甲酰胺： 在雜交液中占 50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。因此，在雜交液中加入鹽和 甲酰胺 ，減低 Tm。 （ 3）雜交的溫度和時間 雜交溫度： DNA或 RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。 500個堿基的探針 雜交時間約需 20h左右。 （ 2）探針的長度 最佳長度應(yīng)在 50～ 100個堿基之間。 雜交液的量要適當 : 以 10～ 20μl/ 每張切片為宜。 雜交注意環(huán)節(jié) （ 1）探針的濃度 原則 :探針濃度必須給予該實驗最大的信 /噪比值。 硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑 ,無氣泡 ,不會影響 組織切片與雜交液的接觸 。 雜交方式 :是將雜
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