【正文】 交（ Prehybridization） : 是減低背景染色的一種有效手段。最佳原 則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合 度為目的。 ? 低嚴(yán)格度： 雜交及沖洗條件在 Tm35– 40℃ 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。 ③ 預(yù)先將切片用 DNA酶或 RNA酶消化，然后用 ISHH技術(shù)證明丟失的是 DNA或 RNA。 ２ 。 18 緩沖液 Ⅰ 洗 2 5min。 地高辛標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 地高辛標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 原理： 地高辛（ Dig）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無(wú)交叉反應(yīng)，地高辛標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（ dUTP）上形成 Dig11dUTP。 下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。 ④ 緩沖液 Ⅰ 漂洗 3 3min；浸入緩沖液 Ⅱ ，室溫 10min。 2023年 3月 上午 11時(shí) 5分 :05March 12, 2023 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 , March 12, 2023 閱讀一切好書(shū)如同和過(guò)去最杰出的人談話。 :05:5911:05Mar2312Mar23 1故人江海別，幾度隔山川。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)ぃ糜谑⒂猩倭? SSC濕盒內(nèi)在 42℃ ， 16～ 18h過(guò)夜。經(jīng)過(guò)上述處理的切片在 20℃ 可保存２～３周，在 70℃ 可保存數(shù)月之久，也有報(bào)告可保存數(shù)年之久的，但仍以新鮮制片為好。 ⑦ 應(yīng)用 ABC復(fù)合物與等量的 1%牛血清白蛋白 PBS液混合，室 溫孵育 1h。 14 5min。 ? 光敏生物素試劑種類： 光生物素（乙酸鹽） 補(bǔ)骨脂素生物素。 放射自顯影： 圖象分析儀檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。 硫酸葡聚糖： 在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占 10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。 加蓋片的目的 防止孵育過(guò)程中的高溫（ 50℃ 左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā) 。 ? 冷凍切片 —— 應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。 特點(diǎn)： 雜交在載玻片上的細(xì)胞進(jìn)行。如冰箱溫度恒定，在 70℃ 可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。 3 雜交（ Hybridisation） 雜交 :核酸探針進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，在雜交液中加入鹽和 甲酰胺 ，減低 Tm。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。而直接標(biāo)記的信號(hào)放大一般受到限制，目前多用 Dupon公司的 TSA系統(tǒng)進(jìn)行直接標(biāo)記信號(hào)的放大。 11 4 SSC洗脫蓋片，并在同一液中， 37℃ 漂洗 1030min。 ④ PBS洗 2 3min。與生物素標(biāo)記探針相比，地高 辛探針不受組織、細(xì)胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。 ⑦ 浸入新鮮配制的 %乙酸酐以封閉非特異性結(jié)合部位。 靜夜四無(wú)鄰，荒居舊業(yè)貧。 2023年 3月 上午 11時(shí) 5分 :05March 12, 2023 1少年十五二十時(shí)，步行奪得胡馬騎。 2023年 3月 上午 11時(shí) 5分 :05March 12, 2023 1業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 , March 12, 2023 很多事情努力了未必有結(jié)果，但是不努力卻什么改變也沒(méi)有。定期卻出切片在顯微鏡下檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度，根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度決定延長(zhǎng)或終止反應(yīng)。其他切片暫放于 PBS內(nèi)。 常用的免疫酶學(xué)檢測(cè)方法： DigHRP檢測(cè)系統(tǒng)： 以 DAB/H2O2為底物，結(jié)果為棕色； 以 4氯 1萘酚 / H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。 21 20mmol/L EDTA， 。 ５ 4%多聚甲醛 PBS固定。由于同一 RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行 ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。 ? 高嚴(yán)格度： 為 Tm1015℃ ，低鹽和高甲酰胺濃度。 （ 2）探針的長(zhǎng)度 最佳長(zhǎng)度應(yīng)在 50～ 100個(gè)堿基之間。 ? 雜交后洗滌 : 采用低濃度的 RNA酶溶液（ 20μg/ml ）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的 RNA酶，減低背景染色。 ? RNA： 易被降解，在 RNA的定位上，要使 RNA的降解減少到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。 ? DNA： 比較穩(wěn)定，對(duì)于 DNA的定位來(lái)說(shuō)，固定劑的種類和濃度并不十分重要。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 雜交液過(guò)多浪費(fèi)，且液量過(guò)多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落 ,過(guò)量 的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，易導(dǎo)致高背景染色等后果。 ? 中嚴(yán)格度