8第八章原位雜交組織化學(xué)-閱讀頁
2025-03-03 11:19本頁面
【正文】 酸鹽） 補骨脂素生物素。 BPA反應(yīng)物與 DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應(yīng)，這個特異性可使 BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。 ２ 。 ４ 1ug/ml蛋白酶 K， 37℃ 保溫 30min。 ６ 3min。 ８ 2 SSC洗 10min。 10 蓋上硅化蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?43℃ 濕盒保溫 12— 16h。 12 2 SSC（含 20ug/mlRNaesA，適于 RNA探針） 37℃ 洗 30min。 14 5min。 16 堿性磷酸酶 室溫 1~3h。 18 緩沖液 Ⅰ 洗 2 5min。 20 NBT/BCIP液 顯色，室溫，暗處 3h。 22 甘油明膠直接封片。 反應(yīng)步驟如下： ① 用 PBS沖洗黏附有切片的載玻片。 ③ PBS洗 2 3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫 1h或 4℃ 過夜。 ⑤ 加生物素化室溫 30min孵育。 ⑦ 應(yīng)用 ABC復(fù)合物與等量的 1%牛血清白蛋白 PBS液混合，室 溫孵育 1h。 ⑨ DAB溶液孵育 315min。 地高辛標記 cRNA探針的應(yīng)用 地高辛標記 cRNA探針的應(yīng)用 原理： 地高辛（ Dig）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無交叉反應(yīng)，地高辛標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（ dUTP）上形成 Dig11dUTP。 將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的抗地高辛抗體結(jié)合物作為酶標或熒光標記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以達到檢測目的。 DigAKP檢測系統(tǒng)： 以 BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍紫色沉淀。 地高辛標記的核酸探針較穩(wěn)定， 20℃ 儲存可達 2年，隨時可以 取用，但在現(xiàn)實應(yīng)用中，人們?nèi)圆捎眯迈r的地高辛標記 36個 月以內(nèi)的核酸探針。 地高辛標記探針具有非放射性探針的優(yōu)點，對人體無害，不受 半衰期限制，探針可長期保存。 由于地高辛標記 cRNA探針在原位雜交細胞化學(xué)中已愈來愈得到 廣泛的應(yīng)用，我們在基本方法中較詳細的敘述其操作過程 。經(jīng)過上述處理的切片在 20℃ 可保存２～３周，在 70℃ 可保存數(shù)月之久，也有報告可保存數(shù)年之久的，但仍以新鮮制片為好。一般不提倡浸入二甲苯溶液，但在細胞內(nèi) mRNA含量高時應(yīng)用二甲苯脫蠟后人能顯示。 下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。 ② 選擇幾張切片作為 RNA酶對照片。 ③ 蛋白激酶 K消化：將組織切片放在 LEDTA中孵育 1520min。 ④ 。 ⑥ 以 PBS漂洗 2 3min。 ⑧ 2 SSC漂洗 15min。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)?，置于盛有少? SSC濕盒內(nèi)在 42℃ ， 16～ 18h過夜。 ② 浸入緩沖液 Ⅰ 中室溫孵育 10min，以封閉非特異性部位。 ④ 緩沖液 Ⅰ 漂洗 3 3min；浸入緩沖液 Ⅱ ，室溫 10min。最好用錫箔紙包裹反映盒，使顯色在黑暗中進行。反應(yīng)顏色為藍紫色。 ⑦ 復(fù)染，可用派咯寧丫 1030s。 ⑨ 以 PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可用 DPX封固。 , March 12, 2023 雨中黃葉樹，燈下白頭人。 :05:5911:05Mar2312Mar23 1故人江海別，幾度隔山川。 :05:5911:05:59March 12, 2023 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 2023年 3月 上午 11時 5分 :05March 12, 2023 1行動出成果，工作出財富。 上午 11時 5分 59秒 上午 11時 5分 11:05: 沒有失敗，只有暫時停止成功！。 11:05:5911:05:5911:053/12/2023 11:05:59 AM 1成功就是日復(fù)一日那一點點小小努力的積累。 11:05:5911:05:5911:05Sunday, March 12, 2023 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 2023年 3月 12日星期日 上午 11時 5分 59秒 11:05: 1楚塞三湘接，荊門九派通。 2023年 3月 12日星期日 11時 5分 59秒 11:05:5912 March 2023 1空山新雨后，天氣晚來秋。 , March 12, 2023 閱讀一切好書如同和過去最杰出的人談話。 :05:5911:05Mar2312Mar23 1越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯兒。勝人者有力，自勝者強。 2023年 3月 12日星期日 上午 11時 5分 59秒 11:05: 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過于提升自我。 2023年 3月 12日星期日 11時 5分 59秒 11:05:5912 March 2023 1一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不
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