8第八章原位雜交組織化學(xué)-文庫吧
2025-02-11 11:19 本頁面
【正文】 根據(jù)應(yīng)用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。 常用方法： 稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑 Triton X100、酒精或某些消化酶等。 優(yōu)點 : 通過去蛋白作用增強組織通透性和探針的穿透性 ,提高雜交信號 . 缺點 : 減低 RNA的保存 ,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài) .因此，在用量及孵育時間上應(yīng)慎為掌握。 （ 3）減低背景染色 ? 預(yù)雜交（ Prehybridization） : 是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。 ? 雜交后洗滌 : 采用低濃度的 RNA酶溶液（ 20μg/ml ）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的 RNA酶，減低背景染色。 （ 4）防止 RNA酶的污染 ① 在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。 ② 所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前一日置高溫烘烤 —— 消除 RNA酶 ,亦可用消毒鍋。 ③ 要破壞 RNA酶，最低溫度必須在 150℃ 左右。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出 時空氣污染。 ⑤ 雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。 3 雜交（ Hybridisation） 雜交 :核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。 是 ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。 雜交方式 :是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。 加蓋片的目的 防止孵育過程中的高溫（ 50℃ 左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā) 。 硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑 ,無氣泡 ,不會影響 組織切片與雜交液的接觸 。 蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。 雜交注意環(huán)節(jié) （ 1）探針的濃度 原則 :探針濃度必須給予該實驗最大的信 /噪比值。最佳原 則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合 度為目的。 雜交液的量要適當 : 以 10～ 20μl/ 每張切片為宜。 雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落 ,過量 的雜交液含核酸探針濃度過高，易導(dǎo)致高背景染色等后果。 （ 2）探針的長度 最佳長度應(yīng)在 50～ 100個堿基之間。 探針短 易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。 500個堿基的探針 雜交時間約需 20h左右。 200～ 500個堿基的探針 可應(yīng)用 . 超過 500個堿基的探針 在雜交前最好用堿或水解酶進 行水解，使其變成短的片段， 達到實驗所需求的堿基數(shù)。 （ 3）雜交的溫度和時間 雜交溫度： DNA或 RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。原位雜交中， DNA、 RNA探針需要的 Tm分別是 90℃ 、 95℃ ，這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和 甲酰胺 ，減低 Tm。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異。 雜交時間： 1620h或孵育過夜 甲酰胺： 在雜交液中占 50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。 硫酸葡聚糖： 在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占 10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。 甲酰胺和硫酸葡聚糖： （ 4）雜交嚴格度（ Hybridization stringency） 雜交嚴格度： 表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。 錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。 ? 低嚴格度： 雜交及沖洗條件在 Tm35– 40℃ 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有 70%～ 90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。 ? 中嚴格度： Tm 2030℃ 的范圍。 ? 高嚴格度： 為 Tm1015℃ ，低鹽和高甲酰胺濃度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。 4 雜交后處理 ? 包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 目的： 通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。
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