8第八章原位雜交組織化學(xué)-wenkub
2023-03-12 11:19:02 本頁面
【正文】 結(jié)構(gòu)有損傷。 ④ 新的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。 特點： 雜交在載玻片上的細胞進行。 分類： 根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同 DNADNA雜交、 DNARNA雜交、 RNARNA雜交 根據(jù)探針標(biāo)記物是否直接被檢測 — 直接法、間接法 一 原位雜交的由來與發(fā)展 （一）核酸分子雜交技術(shù) ? 按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種 ? 液相雜交： 參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。 二 原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù) ? 原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則： ① 雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； ② 雜交； ③ 雜交后處理； ④ 顯示（ visualization）： 放射性自顯影顯色、非放射性標(biāo)記顯色 （一）原位雜交的基本要求 1 固定 2 玻片和組織切片的處理 3 雜交 4 雜交后處理 5 顯示 6 對照實驗和 ISHH結(jié)果的判斷 1 固定 固定劑的應(yīng)用和選擇原則： ① 保持細胞結(jié)構(gòu)； ② 最大限度地保持細胞內(nèi) DNA或 RNA水平； ③ 使探針易于進入細胞或組織 。 戊二醛： 能較好地保存 RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。如冰箱溫度恒定，在 70℃ 可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。 2 玻片和組織切片的處理 （ 1）玻片的處理 熱肥皂刷洗 自來水清洗 清潔液中浸泡 24h 清水洗凈 烘干 95%酒精中浸泡 24h 蒸餾水沖洗 烘干 烘箱溫度 ＞ 150℃ 過夜以去除 RNA酶 蓋玻片硅化處理 錫箔紙包裹無塵存放 （ 2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 根據(jù)應(yīng)用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。 ② 所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實驗前一日置高溫烘烤 —— 消除 RNA酶 ,亦可用消毒鍋。 3 雜交（ Hybridisation） 雜交 :核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。 硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑 ,無氣泡 ,不會影響 組織切片與雜交液的接觸 。 雜交液的量要適當(dāng) : 以 10～ 20μl/ 每張切片為宜。 500個堿基的探針 雜交時間約需 20h左右。因此，在雜交液中加入鹽和 甲酰胺 ，減低 Tm。 甲酰胺和硫酸葡聚糖： （ 4）雜交嚴(yán)格度（ Hybridization stringency） 雜交嚴(yán)格度： 表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。大約有 70%～ 90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導(dǎo)致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。 4 雜交后處理 ? 包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。 非放射性核酸探針雜交的細胞或組織： 酶檢測系統(tǒng)顯色 顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。事先與特異性的 cRNA或 cDNA進行雜交。 多因素都將影響 ISHH的實驗結(jié)果。而直接標(biāo)記的信號放大一般受到限制，目前多用 Dupon公司的 TSA系統(tǒng)進行直接標(biāo)記信號的放大。 生物素 聚乙二醇 當(dāng)歸素（ BPA）：在長波 UV下它可與 DNA堿基共價鍵結(jié)合。 ３ %Trixtion X100 PBS洗 15min。 ７ %乙酸酐 10min。 11 4 SSC洗脫蓋片，并在同一液中， 37℃ 漂洗 1030min。 15 3%BSA（ %Triton X100 PBS配） 37℃ 保溫 30min。 19 緩沖液 Ⅱ 洗 2 5min。 2 酶促生物素標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 原理： 酶促生物素標(biāo)記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加 尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針 DNA 中，制成標(biāo)記探針， 敏感度高于化學(xué)修飾法，但操作程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，成本高。 ④ PBS洗 2 3min。 ⑧ PBS洗 2 3min。通過隨即引物或缺口平移法，將 Dig11dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成 Dig配基標(biāo)記的核酸探針。 AKP靈敏度和分辨率較 HRP高，但 HRP的優(yōu)點為廉價、穩(wěn)定。與生物素標(biāo)記探針相比，地高 辛探針不受組織、細胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。 石蠟包埋切片： 應(yīng)
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