8第八章原位雜交組織化學(xué)(編輯修改稿)
2025-03-11 11:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 洗滌的條件： 如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。 ? 注意事項： 漂洗過程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液 漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強(qiáng)了背景染色。 放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測 背景染色作為改善漂洗程序的指針。 5 顯示 Visualization 又稱檢測系統(tǒng) Detection system 根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢 測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。 放射自顯影： 圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。 非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織： 酶檢測系統(tǒng)顯色 顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。 6 對照實驗和 ISHH結(jié)果的判斷 ① Northern 和 Southern印跡雜交法。 ② 可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和 ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水 平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相 應(yīng) mRNA共存于同一細(xì)胞中。 ③ 預(yù)先將切片用 DNA酶或 RNA酶消化，然后用 ISHH技術(shù)證明丟失的是 DNA或 RNA。事先與特異性的 cRNA或 cDNA進(jìn)行雜交。再進(jìn)行 ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。由于同一 RNA探針和組織內(nèi) mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行 ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。 ④ 檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。 多因素都將影響 ISHH的實驗結(jié)果。 （二）核酸探針 ?1 核酸探針的種類 ?2 探針的標(biāo)記與應(yīng)用 1 核酸探針的種類 （ 1）按標(biāo)記方式分類 直接法和間接法： １）直接標(biāo)記探針 應(yīng)用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（ FITC）或羅丹明 Rhodamine等熒光物質(zhì)的 dNTP或 NTP直接標(biāo)記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。 ２）間接標(biāo)記探針 采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標(biāo)記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進(jìn)行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。 兩種方法的比較： ? （ 1）直接標(biāo)記的 DNA探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯示雜交信號，簡單方便，而間接標(biāo)記的探針雜交后需通過繁瑣的檢測步驟； ? （ 2）間接標(biāo)記的探針可進(jìn)行多步驟信號放大，但其受配基親和力的影響。而直接標(biāo)記的信號放大一般受到限制，目前多用 Dupon公司的 TSA系統(tǒng)進(jìn)行直接標(biāo)記信號的放大。 ? （ 3）對于多色 FISH，往往選擇直接標(biāo)記法標(biāo)記探針。 （ 2）按核酸性質(zhì)分類 ① DNA探針 ② cDNA探針 ③ RNA探針 ④ 寡核苷酸探針 （ 3）按染色體上位置分類： ① 重復(fù)序列探針 ② 涂染探針 ③ 基因探針及其它 2 探針的標(biāo)記與應(yīng)用 ? 切口平移法 （ Nick translation） ? 隨機(jī)引物法 (Random Primer) ? 末端標(biāo)記法 ? PCR標(biāo)記法 ? 體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法 不同模板需不同標(biāo)記方法 生物素標(biāo)記 cRNA探針 在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用 1 光敏生物素標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 2 酶促生物素標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 ? 1 光敏生物素標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 光敏生物素標(biāo)記核酸方法 ， 不需昂貴的酶 ， 只在光照 10～20min， 生物素就結(jié)合在 DNA或 RNA分子上 ， 屬于化學(xué)修飾法 ，此方法簡單；成本低；適用于大量制備 （ 50ug） 。 ? 光敏生物素試劑種類： 光生物素（乙酸鹽） 補(bǔ)骨脂素生物素。 生物素 聚乙二醇 當(dāng)歸素（ BPA）：在長波 UV下它可與 DNA堿基共價鍵結(jié)合。 BPA反應(yīng)物與 DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應(yīng)，這個特異性可使 BPA只標(biāo)記粗制細(xì)胞裂解物中的核酸，而不標(biāo)記蛋白、多糖和其他細(xì)胞大分子。 ? 光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下： １ 石蠟切片脫蠟入水后， PBS洗；冰凍切片直接入 PBS洗。 ２ 。 ３ %Trixtion X100 PBS洗 15min。 ４ 1ug/ml蛋白酶 K， 37℃ 保溫 30min。 ５ 4%多聚甲醛 PBS固定。 ６ 3min。 ７ %乙酸酐 10min。 ８ 2 SSC洗 10min。 ９ 取 10ul含相應(yīng) 探針 的雜
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