8第八章原位雜交組織化學(xué)(完整版)
【正文】 核酸探針的穿透性。 2 玻片和組織切片的處理 （ 1）玻片的處理 熱肥皂刷洗 自來水清洗 清潔液中浸泡 24h 清水洗凈 烘干 95%酒精中浸泡 24h 蒸餾水沖洗 烘干 烘箱溫度 ＞ 150℃ 過夜以去除 RNA酶 蓋玻片硅化處理 錫箔紙包裹無塵存放 （ 2）增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 根據(jù)應(yīng)用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。 ② 所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤 —— 消除 RNA酶 ,亦可用消毒鍋。 硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無雜質(zhì)，光滑 ,無氣泡 ,不會(huì)影響 組織切片與雜交液的接觸 。 500個(gè)堿基的探針 雜交時(shí)間約需 20h左右。 甲酰胺和硫酸葡聚糖： （ 4）雜交嚴(yán)格度（ Hybridization stringency） 雜交嚴(yán)格度： 表示通過雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。 4 雜交后處理 ? 包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織： 酶檢測(cè)系統(tǒng)顯色 顯微分光光度計(jì)或圖像分析儀檢測(cè)。 多因素都將影響 ISHH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 生物素 聚乙二醇 當(dāng)歸素（ BPA）：在長波 UV下它可與 DNA堿基共價(jià)鍵結(jié)合。 ７ %乙酸酐 10min。 15 3%BSA（ %Triton X100 PBS配） 37℃ 保溫 30min。 2 酶促生物素標(biāo)記 cRNA探針的應(yīng)用 原理： 酶促生物素標(biāo)記探針是用缺口平移法，隨機(jī)引物法或末端加 尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針 DNA 中，制成標(biāo)記探針， 敏感度高于化學(xué)修飾法，但操作程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，成本高。 ⑧ PBS洗 2 3min。 AKP靈敏度和分辨率較 HRP高，但 HRP的優(yōu)點(diǎn)為廉價(jià)、穩(wěn)定。 石蠟包埋切片： 應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精脫水。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類，厚度反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整。 3）顯示 ① 用緩沖液 Ⅰ 沖洗雜交后的載波片 2 3min。 ⑥ 將切片浸入緩沖也 Ⅲ 以終止反應(yīng)。 11:05:5911:05:5911:05Sunday, March 12, 2023 1乍見翻疑夢(mèng)，相悲各問年。 :05:5911:05Mar2312Mar23 1世間成事，不求其絕對(duì)圓滿，留一份不足，可得無限完美。 11:05:5911:05:5911:053/12/2023 11:05:59 AM 1越是沒有本領(lǐng)的就越加自命不凡。 上午 11時(shí) 5分 59秒 上午 11時(shí) 5分 11:05: MOMODA POWERPOINT Lorem ipsum dolor sit, eleifend nulla ac, fringilla purus. Nulla iaculis tempor felis amet, consectetur adipiscing elit. Fusce id urna blanditut cursus. 感謝您的下載觀看 專家告訴 。 11:05:5911:05:5911:05Sunday, March 12, 2023 1知人者智，自知者明。 :05:5911:05:59March 12, 2023 1意志堅(jiān)強(qiáng)的人能把世界放在手中像泥塊一樣任意揉捏。 2023年 3月 12日星期日 上午 11時(shí) 5分 59秒 11:05: 1比不了得就不比，得不到的就不要。 ⑧ 流水洗 510min，直至水無色為止。 ③ 加數(shù)滴抗地高辛抗血清，室溫孵育 2h。 ⑤ 在 4%多聚甲醛 /PBS 3min。經(jīng)水洗后經(jīng) 37℃ 烤箱 4h或者過夜，然后進(jìn)行雜交前的處理。為節(jié)省核酸探針的用量，凡使用過的含有 探針的雜交液也可反復(fù)多次使用。 ⑩ 水洗，復(fù)染，脫水，透明和以甘油 /PBS或 DPX封固。 ② 將載玻片浸入 %H2O2，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。 17 5min。 ９ 取 10ul含相應(yīng) 探針 的雜交液滴于標(biāo)本上，如果是 cDNA探 針，則用前將探針于 95℃ 水浴中保溫 10min，馬上冰浴冷 卻，然后再用。 ? 光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下： １ 石蠟切片脫蠟入水后， PBS洗；冰凍切片直接入 PBS洗。 ２）間接標(biāo)記探針 采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標(biāo)記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進(jìn)行檢測(cè)，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。 ② 可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和 ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水 平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相 應(yīng) mRNA共
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