8第八章原位雜交組織化學(xué)-在線瀏覽
2025-03-25 11:19本頁(yè)面
【正文】 的非放射性標(biāo)記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。 ? DNA： 比較穩(wěn)定，對(duì)于 DNA的定位來(lái)說(shuō)，固定劑的種類(lèi)和濃度并不十分重要。 ? 固定劑： 多聚甲醛、醋酸 酒精混合液、 Bouin’ s固定劑、 Carnoy’ s液 優(yōu)缺點(diǎn)： 沉淀性固定劑： 酒精 /醋酸混合液、 Bouin’ s液、 Carnoy’ s液 能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存 RNA， 且對(duì)組織結(jié)構(gòu)有損傷。 多聚甲醛： 仍被公認(rèn)為 ISHH較為理想的固定劑。 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入 4%多聚甲醛約 10min，空氣干燥后保存在 70℃ 。 ? 病理學(xué)活檢取材 —— 福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè) DNA和 mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)。 ? 冷凍切片 —— 應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。 常用方法： 稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱(chēng)清洗劑 Triton X100、酒精或某些消化酶等。 （ 3）減低背景染色 ? 預(yù)雜交（ Prehybridization） : 是減低背景染色的一種有效手段。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。 （ 4）防止 RNA酶的污染 ① 在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套。 ③ 要破壞 RNA酶，最低溫度必須在 150℃ 左右。 ⑤ 雜交前及雜交時(shí)所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。 是 ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。 加蓋片的目的 防止孵育過(guò)程中的高溫（ 50℃ 左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā) 。 蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。最佳原 則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合 度為目的。 雜交液過(guò)多浪費(fèi)，且液量過(guò)多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落 ,過(guò)量 的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，易導(dǎo)致高背景染色等后果。 探針短 易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。 200～ 500個(gè)堿基的探針 可應(yīng)用 . 超過(guò) 500個(gè)堿基的探針 在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn) 行水解，使其變成短的片段， 達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。原位雜交中， DNA、 RNA探針需要的 Tm分別是 90℃ 、 95℃ ，這種高溫對(duì)保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。根據(jù)探針的種類(lèi)不同，溫度略有差異。 硫酸葡聚糖： 在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占 10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強(qiáng)的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進(jìn)雜交率，特別是對(duì)雙鏈核酸探針。 錯(cuò)配對(duì)雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過(guò)控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。 ? 低嚴(yán)格度： 雜交及沖洗條件在 Tm35– 40℃ 之間，高鹽或低甲酰胺濃度。 ? 中嚴(yán)格度： Tm 2030℃ 的范圍。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。 目的： 通過(guò)雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對(duì)除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 ? 注意事項(xiàng)： 漂洗過(guò)程中切勿使切片干燥。 放射性標(biāo)記探針雜交后漂洗過(guò)程中可用底片曝光的方法測(cè) 背景染色作為改善漂洗程序的指針。 放射自顯影： 圖象分析儀檢測(cè)銀粒的數(shù)量和分布的差異。 6 對(duì)照實(shí)驗(yàn)和 ISHH結(jié)果的判斷 ① Northern 和 Southern印跡雜交法。 ③ 預(yù)先將切片用 DNA酶或 RNA酶消化，然后用 ISHH技術(shù)證明丟失的是 DNA或 RNA。再進(jìn)行 ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。 ④ 檢測(cè)系統(tǒng)的對(duì)照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無(wú)標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。 （二）核酸探針 ?1 核酸探針的種類(lèi) ?2 探針的標(biāo)記與應(yīng)用 1 核酸探針的種類(lèi) （ 1）按標(biāo)記方式分類(lèi) 直接法和間接法： １）直接標(biāo)記探針 應(yīng)用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（ FITC）或羅丹明 Rhodamine等熒光物質(zhì)的 dNTP或 NTP直接標(biāo)記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測(cè)。 兩種方法的比較： ? （ 1）直接標(biāo)記的 DNA探針雜交后經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單洗滌就可顯示雜交信號(hào)，簡(jiǎn)單方便，而間接標(biāo)記的探針雜交后需通過(guò)繁瑣的檢測(cè)步驟； ? （ 2）間接標(biāo)記的探針可進(jìn)行多步驟信號(hào)放大，但其受配基親和力的影響。 ? （ 3）對(duì)于多色 FISH，往往選擇直接標(biāo)記法標(biāo)記探針。 ? 光敏生物素試劑種類(lèi)： 光生物素（乙
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