8第八章原位雜交組織化學(xué)-展示頁(yè)
2025-02-27 11:19本頁(yè)面
【正文】 交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。 3 雜交（ Hybridisation） 雜交 :核酸探針進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出 時(shí)空氣污染。 ② 所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫烘烤 —— 消除 RNA酶 ,亦可用消毒鍋。 ? 雜交后洗滌 : 采用低濃度的 RNA酶溶液（ 20μg/ml ）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的 RNA酶，減低背景染色。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。 優(yōu)點(diǎn) : 通過(guò)去蛋白作用增強(qiáng)組織通透性和探針的穿透性 ,提高雜交信號(hào) . 缺點(diǎn) : 減低 RNA的保存 ,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài) .因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。 2 玻片和組織切片的處理 （ 1）玻片的處理 熱肥皂刷洗 自來(lái)水清洗 清潔液中浸泡 24h 清水洗凈 烘干 95%酒精中浸泡 24h 蒸餾水沖洗 烘干 烘箱溫度 ＞ 150℃ 過(guò)夜以去除 RNA酶 蓋玻片硅化處理 錫箔紙包裹無(wú)塵存放 （ 2）增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性 根據(jù)應(yīng)用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長(zhǎng)度而定。 ? 石蠟包埋切片 —— 由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片，同時(shí)，在包埋的過(guò)程中可減低 mRNA的含量。如冰箱溫度恒定，在 70℃ 可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。 多聚甲醛 —— mRNA的定位 將組織固定于 4%多聚甲醛磷酸緩沖液中 1～ 2h，在冷凍前浸入 15%蔗糖溶液中，置 4℃ 冰箱過(guò)夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。 戊二醛： 能較好地保存 RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。 ? RNA： 易被降解，在 RNA的定位上，要使 RNA的降解減少到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。 二 原位雜交組織化學(xué)基本技術(shù) ? 原位雜交的基本方法和應(yīng)用原則： ① 雜交前準(zhǔn)備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等； ② 雜交； ③ 雜交后處理； ④ 顯示（ visualization）： 放射性自顯影顯色、非放射性標(biāo)記顯色 （一）原位雜交的基本要求 1 固定 2 玻片和組織切片的處理 3 雜交 4 雜交后處理 5 顯示 6 對(duì)照實(shí)驗(yàn)和 ISHH結(jié)果的判斷 1 固定 固定劑的應(yīng)用和選擇原則： ① 保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)； ② 最大限度地保持細(xì)胞內(nèi) DNA或 RNA水平； ③ 使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織 。 固相雜交技術(shù)包括： ① 菌落原位雜交 ② 斑點(diǎn)雜交法 ③ Southern印跡雜交 ④ Northern印跡雜交 ⑤ 組織原位雜交 （二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展 在近 20年飛躍發(fā)展的突出特點(diǎn)： ① 由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加； ② 探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了； ③ 非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。 分類： 根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同 DNADNA雜交、 DNARNA雜交、 RNARNA雜交 根據(jù)探針標(biāo)記物是否直接被檢測(cè) — 直接法、間接法 一 原位雜交的由來(lái)與發(fā)展 （一）核酸分子雜交技術(shù) ? 按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種 ? 液相雜交： 參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。第八章 原位雜交組織化學(xué) 原位雜交組織化學(xué)（ ISHH） 原理： 用標(biāo)記的 DNA或 RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸 序列的方法。 特點(diǎn)： 雜交在載玻片上的細(xì)胞進(jìn)行。 液相分子雜交技術(shù)包括： ① 吸附雜交 ② 發(fā)光液相雜交 ③ 液相夾心雜交 ④ 復(fù)性速率液相分子雜交 ? 固相雜交： 是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜 ， 其它如尼龍膜 、 乳膠顆粒和微孔板等 ） ， 另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中 。 ④ 新
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1