原位雜交與凋亡檢測技術-展示頁
2025-05-22 00:53本頁面
【正文】 記的探針在組織切片上檢出病毒 DNA. 1987年 Biochemisca 推出地高辛標記的試劑及藥盒。 1970年 Orth 用 3H標記兔乳頭狀瘤病毒 cRNA探針在冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術檢出細胞中的病毒 DNA。 二、 原位雜交的發(fā)展史： 1 、 1969年美國耶魯大學 Gall和 Pardue 首創(chuàng)用爪蟾核糖體基因探針與卵母細 胞雜交，雜交點定位于核仁。 （ 三 ）核酸的高級結構：根據(jù)堿基配對規(guī)律 DNA： 多核苷酸鏈可形成雙螺旋三、四股螺旋；但有高溫變性，低溫復性的特點。 一、 原位雜交的分子生物學基礎： （一） 核酸的分子結構： C 、 H、 O、 N、 P* 核酸 → 水解 → 多聚核苷酸 → 水解 → 核苷、磷酸 → 水解 → 戊糖、含氮堿（堿基）、磷酸。 原位雜交：在具有明確的結構基礎上， 如一個細菌，一條染色體，細胞或組 織上進行核酸雜交，可以檢測到特定 基因的準確定位。 RNARNA 人工合成寡核苷酸 DNA(RNA) 常用方法： 膜上雜交：用醋酸纖維膜和尼龍膜等作為 載體，將靶基因轉移到膜上，然后用探針 進行雜交，陽性結果顯示為條紋或斑點。 DNADNA。原位分子雜交技術 原位雜交 (in situ hybridization,ISH) 是應用已知堿基順序并帶有標記的核酸探針與組織、細胞中的待測的核酸按堿基配對的原則進行特異的結合而形成雜交體。 再應用與標記物相應的檢測系統(tǒng)，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶有顏色的雜交信號，在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。 RNADNA。 液相雜交：以生物素或丫啶翁酯標記探針在溶液中用羥基磷灰石層析或吸附、親和吸附、磁珠吸附等方法進行雜交，結果于計數(shù)器，光度計或用化學發(fā)光測定。 原位雜交技術的出現(xiàn)是組織化學和免疫組織化學的革命性突破。 （二）核酸的一級機構： 堿基共同成分： 腺嘌呤 (A)， 鳥嘌呤 (G)， 胞嘧啶 (C)； 區(qū)別： DNA含有胸腺嘧啶 (T)； RNA含有尿嘧啶 (U)。RNA： 多核苷酸鏈一般以單鏈存在，僅有時局部形成小雙螺旋結構。同年， BuongiornoNardelli等用同位素標記 核酸探針對細胞和組織進行定位。 1981年 Bauman 應用熒光素標記cRNA探針，在熒光顯微鏡觀察成功。 三、核酸探針的分類： 按標記方法分： 放射性探針：用放射性同位素 32P、35S、 3H標記，通過放射自顯影方法顯示。 非放射性探針：用 FITC, Biotin, DIG, HRP, AP 標記，用相應的檢測系統(tǒng)顯示。 按探針的性質分： DNA探針： 雙鏈：采用 PCR方法，從基因庫釣取或 人工合成。 特點：雙鏈長度較長（數(shù)百 ~數(shù)千個鹼基），信號強， 但滲透性差。 RNA探針：一般為單鏈；采用體外轉錄技術（單向或雙向），用新型載體pSP和 pGEM， 在 SP6 RNA或 T7 RNA聚合酶作用下進行 RNA轉錄而成。 寡核苷酸探針：已知基因序列，由核酸合成儀合成。 四、原位雜交技術的應用： 基因芯片（基因組圖）； 基因表達定位； 轉基因檢測。 雜交： 雜交后處理： 顯示：放射自顯影，組化 或免疫組化顯色。 固定液： (1) 4%的多聚甲醛（加 1/1000 DEPC） (2) 冰醋酸酒精 (3) Bouin 固定劑 (4) 冰凍切片直接在 (1)液 10min （二）玻片處理：載玻片經(jīng)熱肥皂水刷
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