原位雜交與凋亡檢測技術(shù)(參考版)
2025-05-16 00:53本頁面
【正文】 The End 。g/ml， 時間 515分鐘； 標記后洗脫液的濃度應(yīng)注意 (2 SSC) TdT酶易失效，應(yīng)在－ 20℃ 保存； TdT 酶和 DIGdUTP須臨時混合； 顯色時間鏡下控制可達 30分鐘以上。 食管鱗癌角化珠凋亡細胞， TUNEL法。 Tunel染色法： 陽性部位定位于細胞核。 2．標記步驟： 試劑盒內(nèi)容： ① 標記緩沖液（ Labeling Buffer） 1ml ② 蛋白酶 K(Proteinase K)100ul ③ 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（ TdT, 20） 20ul ④ DIGdUTP( 20) 20ul ⑤ 封閉液（ Blocking Reagent） 2ml ⑥ 生物素化抗地高辛抗體（ 100） 20ul /堿性磷酸酶抗地高辛抗體 ⑦ SP試劑（ 100） 20ul 自備：顯色液： DAB或 BCIP/NBT。 ② 冰凍切片 4%多聚甲醛 4℃ 固定 30分鐘或 80%乙醇固定 2小時 （ 4）保存：石蠟塊 － 20℃ 保存，時間不超過半年。 （ 2）固定液： 10%中性福爾馬林、4%多聚甲醛、 80%乙醇。（檢測凋亡細胞的特異性手段）。 （ 2）掃描電鏡：細胞呈波浪狀或細胞表面結(jié)構(gòu)改變，如偽足，微絨毛消失等。 ② 核：染色質(zhì)致密，凝集成塊狀，邊集于核膜處 →→ 胞核裂解。 *PI染色因 PI同時與 RNA結(jié)合，應(yīng)先用 RNA酶消化（ 37℃ 15分鐘） 白血病細胞 HL60 APOBRDU 鼻咽癌細胞 Hoechst33342/PI雙染熒光顯微鏡 400 （三）凋亡細胞的電鏡觀察： 組織處理：組織、細胞固定、包埋、 染色與一般電鏡標本相同。 熒光染料： PI(propidium iodide) 5~10ug/ml DAPI（ 4’， 6’— diamidino2phenylindole） 1~2/ug/ml 7AAD(7aminoactinomycin D) 10~20/ ug/ml Hoechst 33342（ + 雙蒸 10ml） /PI 雙染色。圓形 或卵圓形、大小不等，胞漿濃縮，強嗜酸性， 可有或無固縮深染的核碎片。 細胞形態(tài)： （ 1）凋亡細胞：體積縮小，胞漿濃縮、 紅染，核固縮深染或碎裂。 （ 2）防脫片： 1%牛血清白蛋白、卵蛋白、處理玻片。 三、凋亡細胞的形態(tài)學(xué)： 普通光學(xué)顯微鏡下形態(tài)： 組織處理：一般無特殊。 *細胞凋亡時內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或 DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與 DNA斷點數(shù)目相同的 3’ — OH末端；利用末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶將地高辛標記的 dUTP結(jié)合在 3’ — OH末端，再通過酶聯(lián)反應(yīng)，最后用顯色劑予以顯色。 光學(xué)顯微鏡 HE染色觀察凋亡細胞： 核染色質(zhì)濃縮、碎片形成（為時已晚）。 試劑盒內(nèi)包括：蛋白酶 K， 含標記探針的雜交液，封閉液及檢測系統(tǒng)等主要試劑；由于每種試劑都經(jīng)過最優(yōu)化檢測后配制， 所以成功率高，操作也簡便，使原位雜交在一般實驗室進行成為可能。 腎小管細胞核 HBVDNA， 細胞質(zhì) HBsAg 雙（ +）， ISHIHC 肝細胞 HBVDNA ， HBsAg 雙（ +）， ISHIHC 原位雜交是一個很復(fù)雜的操作過程，許多條件不好掌握。 用不同的顯色液，一般先用 DAB, 后用 CIP/NBT顯色，分別顯成棕黃色和紫藍色。 原位雜交完成后不顯色，在加堿
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