原位雜交與凋亡檢測技術(shù)-wenkub
2023-05-28 00:53:24 本頁面
【正文】 DNA探針： 雙鏈：采用 PCR方法，從基因庫釣取或 人工合成。 三、核酸探針的分類： 按標(biāo)記方法分： 放射性探針：用放射性同位素 32P、35S、 3H標(biāo)記，通過放射自顯影方法顯示。同年， BuongiornoNardelli等用同位素標(biāo)記 核酸探針對細胞和組織進行定位。 （二）核酸的一級機構(gòu)： 堿基共同成分： 腺嘌呤 (A)， 鳥嘌呤 (G)， 胞嘧啶 (C)； 區(qū)別： DNA含有胸腺嘧啶 (T)； RNA含有尿嘧啶 (U)。 液相雜交：以生物素或丫啶翁酯標(biāo)記探針在溶液中用羥基磷灰石層析或吸附、親和吸附、磁珠吸附等方法進行雜交，結(jié)果于計數(shù)器，光度計或用化學(xué)發(fā)光測定。 再應(yīng)用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在被檢測的核酸原位形成帶有顏色的雜交信號，在顯微鏡下進行細胞內(nèi)定位。 DNADNA。 原位雜交：在具有明確的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上， 如一個細菌，一條染色體，細胞或組 織上進行核酸雜交，可以檢測到特定 基因的準(zhǔn)確定位。 （ 三 ）核酸的高級結(jié)構(gòu)：根據(jù)堿基配對規(guī)律 DNA： 多核苷酸鏈可形成雙螺旋三、四股螺旋；但有高溫變性，低溫復(fù)性的特點。 1970年 Orth 用 3H標(biāo)記兔乳頭狀瘤病毒 cRNA探針在冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交技術(shù)檢出細胞中的病毒 DNA。 特點：靈敏度高，輻射危害，耗時久，半衰期限制。 單鏈：將 DNA片段裝載到質(zhì)?；蚓w中，以此為模板用 Taq酶合成互補單 DNA探針或以 RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈 cDNA探針。 特點：長度隨意，穩(wěn)定，信號更強。 核 DNA和 RNA 的 mRNA的排列和運輸，復(fù)制和細胞分類 細胞遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷、腫瘤診斷 病毒學(xué)和病原學(xué)、傳染性疾病的診斷 生物學(xué)劑量的測定 五、原位雜交技術(shù)的基本方法： 包括： 雜交前準(zhǔn)備：固定、取材、 玻片和組織處理，增強核酸探針的穿透性，減低背景染色等。 玻片粘附劑：多聚賴氨酸， APES。 （四）、增強組織的通透性和核酸探針的穿透性： Triton X100 蛋白酶 K（ Proteinase K 1ug/ml） 37 0C 15~20 min 胃蛋白酶（ Pepsin 20~100ug/ml） 37 0C 30 min 上述酶消化后用 4%多聚甲醛后固定。 （六） 預(yù)雜交：用不含探針和硫酸葡聚糖的液體封閉非特異性雜交點。 組織切片置于盛有 2 SSC溶液的濕盒中孵育。 （ 九）顯示（使用檢測系統(tǒng)）： 放射自顯影（略）。 吸收試驗：用 cDNA或 cRNA探針進行預(yù)雜交。 六、原位雜交實際操作舉例： DNA 與 mRNA原位雜交步驟 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟到水。 DNA雜交： 切片置于 2 SSC中，微波爐加熱 95~ 100℃ 10分鐘；迅速插入冰水 2分鐘； DNA探針于 90 ℃ 水中 10分鐘 ,迅速插入碎冰 3分鐘； 雜交：切片在空氣干燥后，按每張切片加 20μl含地高辛標(biāo)記的 DNA/RNA探針原位雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上，恒溫箱 37 ~ 400C過夜。 滴加封閉液：室溫 20分鐘，不洗。 1 PBS洗 5分鐘 3次。 1酒精脫水，二甲苯透明，封片。 （ 2）陽性著色強度：按弱、中、強三 級分別為 3分。 注意事項： 先做原位雜交（因 mRNA易被降 解），后做免疫組化。
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