第十章核酸分子雜交技術-wenkub
2022-10-28 15:27:36 本頁面
【正文】 原理 ? 具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。 （ 2）酸堿變性： pH值低于 3或高于 10時，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 復性過程 （ 1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈 （ 2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離 （ 3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列 （ 4）形成完整的雙鏈分子 復性的速率方程（服從二級反應動力學） dC dt =K2C2 （ 1） 將（ 1）積分 C Co 1 1+K2Cot = （ 2） 一半單鏈 DNA分子復性時，（ 2）式中的 為 1 2 1 2 1 1+K2Cot = Cot1/2值越大，復性速度越慢 C Co （ 3） 1 K2 Cot1/2= 二、影響雜交的因素 核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復性速度越快 分子越大，復性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在 ~,濃度過高影響雜 交效率 溫度： （ 1） DNA/DNA雜交，適宜溫度較 Tm值低 20~25℃ （ 2） RNA/DNA或 RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （ 3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較 Tm值低 5℃ 離子強度： （ 1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （ 2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 甲酰胺： （ 1）甲酰胺能降低核酸雜交的 Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加 50%甲酰胺溶液在35~42 ℃ 雜交 （ 2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在 68℃ 雜交 核酸分子的復雜性： （ 1）核酸的復雜性是指存在于反應體系中不同順序的總長度 （ 2） Cot189。 其基本原理是：容器中的轉移緩沖液含有高濃度的 NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的 DNA片段垂直向上運動，凝膠中的 DNA片段移出凝膠而滯留在膜上 （ 2）電轉法 利用電場的電泳作用將凝膠中的 DNA轉移到固相支持物上。 （一） RNA酶保護分析法 RNA酶保護分析法原理 RNaseA和 RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈 RNA，不水解探針 RNA與待測 RNA互補形成的雙鏈 RNA，使雜交分子得到保護，稱 RNA酶保護分析法。gDNA以上 可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記 （三） PCR標記法： 將標記的核苷酸作為 PCR反 應的底物，以待標記的 DNA為模板，經PCR反應，標記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中
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