第十章核酸分子雜交技術(shù)-wenkub
2022-10-28 15:27:36 本頁(yè)面
【正文】 原理 ? 具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。 （ 2）酸堿變性： pH值低于 3或高于 10時(shí)，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 復(fù)性過(guò)程 （ 1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈 （ 2）局部雙鏈周?chē)膲A基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離 （ 3）局部雙鏈周?chē)膲A基如配對(duì)，則形成中心序列 （ 4）形成完整的雙鏈分子 復(fù)性的速率方程（服從二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)） dC dt =K2C2 （ 1） 將（ 1）積分 C Co 1 1+K2Cot = （ 2） 一半單鏈 DNA分子復(fù)性時(shí)，（ 2）式中的 為 1 2 1 2 1 1+K2Cot = Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢 C Co （ 3） 1 K2 Cot1/2= 二、影響雜交的因素 核酸分子的濃度和長(zhǎng)度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在 ~,濃度過(guò)高影響雜 交效率 溫度： （ 1） DNA/DNA雜交，適宜溫度較 Tm值低 20~25℃ （ 2） RNA/DNA或 RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （ 3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較 Tm值低 5℃ 離子強(qiáng)度： （ 1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （ 2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 甲酰胺： （ 1）甲酰胺能降低核酸雜交的 Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加 50%甲酰胺溶液在35~42 ℃ 雜交 （ 2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在 68℃ 雜交 核酸分子的復(fù)雜性： （ 1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長(zhǎng)度 （ 2） Cot189。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的 NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過(guò)濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的 DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的 DNA片段移出凝膠而滯留在膜上 （ 2）電轉(zhuǎn)法 利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 （一） RNA酶保護(hù)分析法 RNA酶保護(hù)分析法原理 RNaseA和 RNaseT1專(zhuān)一水解雜交體系中的單鏈 RNA，不水解探針 RNA與待測(cè) RNA互補(bǔ)形成的雙鏈 RNA，使雜交分子得到保護(hù)，稱(chēng) RNA酶保護(hù)分析法。gDNA以上 可直接在低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記 （三） PCR標(biāo)記法： 將標(biāo)記的核苷酸作為 PCR反 應(yīng)的底物，以待標(biāo)記的 DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中
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