第十章核酸分子雜交技術-資料下載頁
2024-10-09 15:27本頁面
【正文】 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學發(fā)光探針：標記物與某種底物反應發(fā)光， 如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光 三、標記方法 體內標記法： 將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使 核素摻入到新合成的核酸分子中，如 3H胸苷可摻入到 DNA中， 3H尿苷可摻入到 RNA中 體外標記法： 化學標記法：標記物分子上的活性基因與 探針分子上的某些基因反應， 標記物直接結合到探針分子上 酶促標記法：標記物預先標記核苷酸，然 后利用酶促法將標記的核苷酸 摻入到探針上 酶促標記法 （一）切口平移法（ nick translation) 利用 DNase I在 DNA雙鏈上造成單鏈切口 利用大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 5??3?核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從 5?末端逐步切除 在 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合酶催化下，以互補的 DNA單鏈為模板依次將 dNTP連接到切口的 3?末端 OH上，合成新的 DNA鏈，同時將標記的核苷酸摻入到新的 DNA鏈中 （二）隨機引物法 其原理是隨機引物能與各種單鏈 DNA模板結合，作為合成新鏈的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按 5??3?方向合成一新的 DNA鏈，其核苷酸序列與模板 DNA完全互補。另一單鏈 DNA模板同樣合成一條新的完全互補的 DNA鏈。合成時，帶放射性核素標記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中 隨機引物法所具有的優(yōu)點： 能進行雙鏈 DNA、單鏈 DNA或 RNA探針的標記 操作簡單方便，避免因 DNaseI處理濃度掌握不當所帶來的一系列問題 標記活性高，標記活性可達 108cpm/181。gDNA以上 可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記 （三） PCR標記法： 將標記的核苷酸作為 PCR反 應的底物，以待標記的 DNA為模板，經PCR反應，標記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中 四、探針的純化 乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀 DNA片段，可去除 dNTP和蛋白質 凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子 DNA和小分子 dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（ 80bp)等物質分離，常用凝膠基質是 Sephadex G50 微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針
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