第十章核酸分子雜交技術(shù)-文庫吧
2024-09-29 15:27 本頁面
【正文】 交率增加 （ 2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度 甲酰胺： （ 1）甲酰胺能降低核酸雜交的 Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測核酸與探針同源性不高時，加 50%甲酰胺溶液在35~42 ℃ 雜交 （ 2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水溶液在 68℃ 雜交 核酸分子的復(fù)雜性： （ 1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度 （ 2） Cot189。與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成正比 （ 3）兩個 DNA樣品濃度絕對一致時，變性后的相對雜交率取決于 DNA的相對復(fù)雜性 非特異性雜交反應(yīng)： （ 1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附 （ 2）常用的封閉物有兩類：即非特異性 DNA和高分子化合物。如鮭精 DNA或小牛胸腺 DNA， Denharts溶液或脫脂奶粉 第二節(jié) 核酸分子雜交的方法 按待測核酸是否固定在固相支持物上分： ? 固 液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 ? 液相雜交 RNA酶保護分析法 核酸酶 S1保護分析法 一、 Southern印跡雜交 （一）待測核酸樣品的制備 裂解或破碎細胞 抽取純化基因組 DNA 限制酶消化 DNA為大小不同的 DNA片段 （二）待測 DNA樣品的電泳分離 瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢 ,小分子 DNA泳動快， 大小 相同的分子處于同一條帶 分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng) HindⅢ 消化的 λDNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記 （三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于 NaOH溶液中使 DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 （四） Southern印跡 指將電泳分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程 固相支持物的選擇 （ 1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 ①具有較強結(jié)合核酸分子的能力 ②不影響與探針的雜交反應(yīng) ③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 ④具有良好的機械性能 ?非特異吸附少 （ 2）常用的固相支持物 ①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是 DNA分子結(jié)合不牢固 ②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈 DNA的能力比硝酸
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