第十章核酸分子雜交技術(shù)(編輯修改稿)
2024-10-27 15:27 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 ③化學(xué)活化膜：優(yōu)點： DNA與膜共價結(jié)合；對不同 大小的 DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低 Southern印跡的常用方法 （ 1）毛細管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的 NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的 DNA片段垂直向上運動，凝膠中的 DNA片段移出凝膠而滯留在膜上 （ 2）電轉(zhuǎn)法 利用電場的電泳作用將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 （ 3）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。 （五） Southern雜交 預(yù)雜交：封閉膜上能與 DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含 DNA探針的雜交液 雜交：液相中的 DNA探針與膜上的待測 DNA雜交 雙鏈 DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA （六）雜交結(jié)果檢測 放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針 比色或化學(xué)發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針 （七） Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 酶切圖譜分析 特定基因定性和定量 基因突變分析 限制性片段長度多態(tài)性的分析 二、 Northern印跡雜交 基本原理和基本過程與 Southern blot基本相同 鑒別 RNA 探針可用 DNA或 RNA片段 待測樣品為總 RNA或 mRNA Northern印跡與 Southern 印跡的不同點 變性： RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持 RNA處于變性狀態(tài)， DNA電泳前和電泳 中不變性 轉(zhuǎn)膜： RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理 ,Southern 印跡時， DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 靶核酸為 RNA 三、斑點及狹縫印跡雜交 斑點印跡為圓形 狹縫印跡為線狀 鑒別 DNA、 RNA 簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 特異性不高、不能鑒別核酸分子量 四、原位雜交 定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分： DNA/DNA、 RNA/DNA、RNA/RNA 雜交 ? 保持組織細
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