原位雜交與凋亡檢測(cè)技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-05-13 00:53本頁(yè)面
【正文】 胞質(zhì)多發(fā)性芽突，芽突脫落 →→ 凋亡小體（胞膜包繞，其中含有不同程度退變的細(xì)胞器和脂滴、核碎片可有可無(wú)）。 （ 2）掃描電鏡：細(xì)胞呈波浪狀或細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)改變，如偽足，微絨毛消失等。 （四）凋亡細(xì)胞的原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記：（ TdTmediated dUTP nick end labeling ， TUNEL method） 原理：細(xì)胞凋亡 →→ 細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切 酶被激活 →→ 核染色質(zhì) DNA雙鏈斷裂 →→ 露 出 3’ OH末端 DNA片段 → TDT酶 →→ 與生物素 或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合 →→ 熒光素 /酶鏈 標(biāo)記卵白素 /抗地高辛抗體結(jié)合 →→ 凋亡細(xì)胞 原位顯示。（檢測(cè)凋亡細(xì)胞的特異性手段）。 組織處理： （ 1）新鮮標(biāo)本：人體組織離體后迅速固定，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可用內(nèi)灌注后處死。 （ 2）固定液： 10%中性福爾馬林、4%多聚甲醛、 80%乙醇。 （ 3）固定時(shí)間： ① 活組織不超過(guò) 24小時(shí)，最好在 4小時(shí)以?xún)?nèi)。 ② 冰凍切片 4%多聚甲醛 4℃ 固定 30分鐘或 80%乙醇固定 2小時(shí) （ 4）保存：石蠟塊 － 20℃ 保存，時(shí)間不超過(guò)半年。冰凍切片－ 20℃ 保存，時(shí)間不超過(guò)一月。 2．標(biāo)記步驟： 試劑盒內(nèi)容： ① 標(biāo)記緩沖液（ Labeling Buffer） 1ml ② 蛋白酶 K(Proteinase K)100ul ③ 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（ TdT, 20） 20ul ④ DIGdUTP( 20) 20ul ⑤ 封閉液（ Blocking Reagent） 2ml ⑥ 生物素化抗地高辛抗體（ 100） 20ul /堿性磷酸酶抗地高辛抗體 ⑦ SP試劑（ 100） 20ul 自備：顯色液： DAB或 BCIP/NBT。 Tunel法實(shí)驗(yàn)操作步驟 二甲苯脫蠟， 10分鐘 3次； 經(jīng)梯度酒精至蒸餾水； % NaCl、 PBS各洗 5分鐘； 4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)前固定 15分鐘； 1 PBS()洗 5分鐘 3次 蛋白酶 K消化，室溫下 12min PBS洗 5分鐘 1次 4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)后固定 5分鐘 PBS洗 5分鐘 3次 標(biāo)記緩沖液室溫下 10分鐘 1 TdT和 BiodUTP混合液 370C孵育 70分鐘 1 2 SSC 洗 15分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 % H2O2 5分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 SP 室溫 30分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 DAB顯色 30分鐘 1蘇木素復(fù)染、酒精脫水、封片。 Tunel染色法： 陽(yáng)性部位定位于細(xì)胞核。 甲狀腺癌細(xì)胞核（ +）， TUNEL 肝組織 TUNEL ， AP反應(yīng) 食管鱗癌角化珠凋亡細(xì)胞， TUNEL法。 食管鱗癌角化珠凋亡細(xì)胞， TUNEL法。 鼻咽鱗癌細(xì)胞系 TUNEL染色 腦星形細(xì)胞瘤 細(xì)胞核（ +） TUNEL 干燥綜合征淚腺核（+），TUNEL Tunel法染色注意事項(xiàng)： 切片脫蠟務(wù)必干凈； 蛋白酶 K濃度及時(shí)間（新舊蠟塊不同）濃度 20181。g/ml， 時(shí)間 515分鐘； 標(biāo)記后洗脫液的濃度應(yīng)注意 (2 SSC) TdT酶易失效，應(yīng)在－ 20℃ 保存； TdT 酶和 DIGdUTP須臨時(shí)混合； 顯色時(shí)間鏡下控制可達(dá) 30分鐘以上。 （五）、凋亡檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用： 某些疾病發(fā)生機(jī)理的研究； 腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的研究； 藥物療效的檢測(cè)。 The End
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