原位雜交與凋亡檢測技術(shù)-資料下載頁
2025-05-13 00:53本頁面
【正文】 胞質(zhì)多發(fā)性芽突，芽突脫落 →→ 凋亡小體（胞膜包繞，其中含有不同程度退變的細胞器和脂滴、核碎片可有可無）。 （ 2）掃描電鏡：細胞呈波浪狀或細胞表面結(jié)構(gòu)改變，如偽足，微絨毛消失等。 （四）凋亡細胞的原位末端轉(zhuǎn)移酶標記：（ TdTmediated dUTP nick end labeling ， TUNEL method） 原理：細胞凋亡 →→ 細胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切 酶被激活 →→ 核染色質(zhì) DNA雙鏈斷裂 →→ 露 出 3’ OH末端 DNA片段 → TDT酶 →→ 與生物素 或地高辛標記的核苷酸結(jié)合 →→ 熒光素 /酶鏈 標記卵白素 /抗地高辛抗體結(jié)合 →→ 凋亡細胞 原位顯示。（檢測凋亡細胞的特異性手段）。 組織處理： （ 1）新鮮標本：人體組織離體后迅速固定，動物實驗可用內(nèi)灌注后處死。 （ 2）固定液： 10%中性福爾馬林、4%多聚甲醛、 80%乙醇。 （ 3）固定時間： ① 活組織不超過 24小時，最好在 4小時以內(nèi)。 ② 冰凍切片 4%多聚甲醛 4℃ 固定 30分鐘或 80%乙醇固定 2小時 （ 4）保存：石蠟塊 － 20℃ 保存，時間不超過半年。冰凍切片－ 20℃ 保存，時間不超過一月。 2．標記步驟： 試劑盒內(nèi)容： ① 標記緩沖液（ Labeling Buffer） 1ml ② 蛋白酶 K(Proteinase K)100ul ③ 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（ TdT, 20） 20ul ④ DIGdUTP( 20) 20ul ⑤ 封閉液（ Blocking Reagent） 2ml ⑥ 生物素化抗地高辛抗體（ 100） 20ul /堿性磷酸酶抗地高辛抗體 ⑦ SP試劑（ 100） 20ul 自備：顯色液： DAB或 BCIP/NBT。 Tunel法實驗操作步驟 二甲苯脫蠟， 10分鐘 3次； 經(jīng)梯度酒精至蒸餾水； % NaCl、 PBS各洗 5分鐘； 4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)前固定 15分鐘； 1 PBS()洗 5分鐘 3次 蛋白酶 K消化，室溫下 12min PBS洗 5分鐘 1次 4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)后固定 5分鐘 PBS洗 5分鐘 3次 標記緩沖液室溫下 10分鐘 1 TdT和 BiodUTP混合液 370C孵育 70分鐘 1 2 SSC 洗 15分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 % H2O2 5分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 SP 室溫 30分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 DAB顯色 30分鐘 1蘇木素復(fù)染、酒精脫水、封片。 Tunel染色法： 陽性部位定位于細胞核。 甲狀腺癌細胞核（ +）， TUNEL 肝組織 TUNEL ， AP反應(yīng) 食管鱗癌角化珠凋亡細胞， TUNEL法。 食管鱗癌角化珠凋亡細胞， TUNEL法。 鼻咽鱗癌細胞系 TUNEL染色 腦星形細胞瘤 細胞核（ +） TUNEL 干燥綜合征淚腺核（+），TUNEL Tunel法染色注意事項： 切片脫蠟務(wù)必干凈； 蛋白酶 K濃度及時間（新舊蠟塊不同）濃度 20181。g/ml， 時間 515分鐘； 標記后洗脫液的濃度應(yīng)注意 (2 SSC) TdT酶易失效，應(yīng)在－ 20℃ 保存； TdT 酶和 DIGdUTP須臨時混合； 顯色時間鏡下控制可達 30分鐘以上。 （五）、凋亡檢測技術(shù)的應(yīng)用： 某些疾病發(fā)生機理的研究； 腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的研究； 藥物療效的檢測。 The End
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