【正文】 kb BCL2 ISH Detection Kit BCL－ 2原位雜交檢測(cè)試劑盒使用說明書 產(chǎn)品編號(hào) ： HK1050 保存 ：置 4℃ 工作量 ： 100張切片 有效期 ：一年 BCL2是主要的抗凋亡基因 。 本試劑盒采用針對(duì)人 、大鼠 、 小鼠的 BCL2特異性寡核苷酸探針 ， 經(jīng)地高辛標(biāo)記 。 由于采用多相寡核苷酸探針和高敏感標(biāo)記技術(shù) ， 并配合使用敏感性加強(qiáng)型的原位檢測(cè)方法 ， 具有敏感性特別高 ， 背景清晰 ， 結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn) 。 可以檢測(cè)出常規(guī)福爾馬林固定 ， 石蠟包埋標(biāo)本的 BCL2 mRNA序列 。 針對(duì)人的 BCL2的寡核苷酸探針序列： 5’TGCGA CAGCT TATAA TGGAT GTACT TCATC3’； 5’GTGAA GGGCG TCAGG TGCAG CTGGC TGGAC3’； 5’AGGTG CCGGT TCAGG TACTC AGTCA TCCAC3’。 上述序列和大鼠 、 小鼠的序列僅 3bp/90bp不同 。 兔和人序列基本相同 。 適用種屬 : 人 、 大鼠 、 免 、 小鼠組織 。 試劑盒中內(nèi)容： 1. 胃蛋白酶 （ 10； Pepsin） 2ml； 2. 預(yù)雜交液 2ml； 3. BCL2寡核苷酸探針雜交液 2ml； 4. 封閉液 5ml； 5. 生物素化鼠抗地高辛 5ml； 6. SABCPOD 5ml； 7. 生物素化過氧化物酶 5ml。 用戶自備試劑： 原位雜交專用蓋玻片 （ 博士德有售 ） ：POLY－ L－ LYSINE； DEPC； 20%甘油緩沖液（ 3%檸檬酸 ， 1 SSC， SSC, SSC, PBS） 一、培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片 準(zhǔn)備工作： 緩沖液的配備 3％檸檬酸： 100ml蒸餾水中加檸檬酸（ C6H8O7?H2O）3g， pH 。 2 SSC： 1000ml蒸餾水中加氫化鈉 ，檸檬酸三鈉（ C6H5O7Na3?2H2O，分子量 294） 。 SSC： 300ml蒸餾水加 100ml 2 SSC即可。 SSC： 270ml蒸餾水加 30ml 3 SSC即可。 20％甘油： 20ml甘油加 80ml蒸餾水即可。 PBS： 1000ml蒸餾水加氯化鈉 30g，Na2HPO4?12H2O 6g， NaH2PO4?2H2O ， 。 操作程序： 注意： 最重要的是及時(shí)固定 ， 并在固定液中加入 ％ 的 DEPC處理 ， 以抑制 RNA酶對(duì) mRNA的分解作用 。 此外 ， 過度固定對(duì)原位雜交有明顯的不利影響 。 1. 玻片的處理： 一般采用多聚賴氨酸或 APES。 切片厚度 20μm。 2. 細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng) ， 條件為 37℃ 和 5％ 的 CO2， 所用培養(yǎng)基為 Dubecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基 。 細(xì)胞長(zhǎng)好后 PBS（ pH ） 洗 2分鐘 3次 。 3. 培養(yǎng)細(xì)胞和冰凍切片均可用下述方法固定： 固定液為 4％ 多聚甲醛／ PBS（ pH ） ， 含有 1／1000 DEPC。 室溫固定 3060分鐘 。 蒸餾水充分洗滌 ，干燥后 20℃ 冰凍可保存 2周以上 。 4. 新鮮配制 ％ H2O2／甲醇室溫處理 30分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶 。 蒸餾水洗滌 3次 。 5. 暴露 mRNA核酸片段： 切片上摘加 3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶 （ 1ml 3%檸檬酸加 2滴濃縮型胃蛋白酶 ， 混勻 ） ， 37℃ 消化 30120秒鐘 。 有時(shí)也可以不消化 。 PBS洗 3次 5分鐘 。 蒸餾水洗 1次 。 6. 預(yù)雜交： 濕盒的準(zhǔn)備：干的雜交盒底部加 20％ 甘油20ml以保持濕度 。 按每張切片加 20 μl預(yù)雜交液 。 恒溫箱3740℃ 24小時(shí) 。 吸取多余液體 ， 不洗 。 7. 雜交： 按每張切片 20μl雜交液 ， 加在切片上 。 將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后 ， 蓋在切片上 。 恒溫箱4042℃ 雜交過夜 。 9. 滴加封閉液： 37℃ 30分鐘 。 甩去多余液體 ， 不洗 。 10. 滴加生物素化鼠抗地高辛： 37℃ 60分鐘或 20℃ 左右120分鐘 。 05M PBS洗 5分鐘 4次 。 勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌 。 11. 滴加 SABC： 37℃ 20分鐘或 20℃ 左右 30分鐘 。 PBS洗 5分鐘 3次 。 勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌 。 12. 滴加生物素化過氧化物酶： 37℃ 20或 20℃ 左右 30分鐘 。 PBS洗 5分鐘 4次 。 13. DAB顯色 : 使用 DAB顯色試劑盒 1ml蒸餾水加顯色劑A、 B、 C各一滴 ， 混勻 ， 加至標(biāo)本上 。 一般顯色 2030分鐘 。 若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色 。 也可自配 DAB顯色劑后顯色 。 充分水洗 。 14. 必要時(shí)蘇木素更染 ， 充分水洗 。 15. 酒精脫水 ， 二甲苯透明 ， 封片 。 二、石蠟切片 如果有條件的話 ， 應(yīng)盡可能地采用新鮮標(biāo)本 。 標(biāo)本離體后 ， 及時(shí)予以固定 。 固定液為 4％ 多聚甲醛/ PBS（ ） ， 含有 1/1000 DEPC。 標(biāo)本較大時(shí)用刀片切成厚度不超過 4mm的小塊 ， 固定 2小時(shí)即可 ， 較大的標(biāo)本固定不要超過 4小時(shí) 。 某些組織對(duì)過度固定大其敏感 ， 如動(dòng)物大腦 ， 固定時(shí)間一定不要超過 1小時(shí) 。 1. 常規(guī)脫水 、 浸蠟 、 包埋 。 切片厚度 68μm。 2. 玻片的處理： 一般采用多聚賴氨酸或 APES。 3. 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水 。 3%H2O2室溫處理 10分鐘 。 蒸餾水洗滌 2次 。 4. 暴露 mRNA核酸片段： 切片上滴加 3％ 檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶 （ 1ml 3％ 檸檬酸加 2滴濃縮型胃蛋白酶 ，混勻 ） ， 37℃ 消化 1060分鐘 。 用戶可以比較不同的消化時(shí)間 ， 例如 10分鐘 ， 20分鐘 ， 30分鐘和 60分鐘 ， 以找到最佳的消化時(shí)間 。 PBS洗 3次 5分鐘 。 蒸餾水洗1次 。 其余步驟 和冰凍切片 615步相同 。 結(jié)果觀察： BCL2 mRNA的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色 。 注意事項(xiàng)： 如果有少量的細(xì)胞核著色屬于正常情況；如果出現(xiàn)大量的細(xì)胞核著色 ， 往往和標(biāo)本固定時(shí)間過長(zhǎng)有關(guān) ， 應(yīng)重新處理標(biāo)本 。 有其它明顯的非特異性染色現(xiàn)象時(shí) ， 可以用預(yù)雜交液對(duì)含探針的雜交液進(jìn)行稀釋 ， 一般稀釋 25倍 。