食品安全快速檢測技術7分子雜交技術-資料下載頁
2025-01-06 10:14本頁面
【正文】 酶高 10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應可持續(xù)幾個小時，其顯色結果可長期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應僅能持續(xù) 30分鐘。 5) 雜交結果 2. 蛋白質 的免疫分析 封閉劑 ， 明膠 ， 牛血清蛋白 ， 卵清蛋白等 。 EtB r 雜交 EtB r 雜交雜交結果示意圖 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 探針的選擇 在大多數情況下，可以選擇克隆的 DNA或 cDNA雙鏈探針 在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的 DNA單鏈探針或RNA探針 長的雙鏈 DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交 ? 探針的標記方法 選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定； 但還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等 一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高 在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng) 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 探針的濃度 總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加 在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加 膜雜交中 32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為 5～10ng/ml和 25～ 1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為 ～ 受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 雜交率 現(xiàn)代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進行 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對靶序列雜交的情形 t1/2=ln2/kc t1/2半數探針與固定靶序列雜交所需的時間（ s） k =形成雜交體的速率常數 [mol/(Lxntxs)]決定于探針長度（ L）、探針復雜度（ N）、溫度、離子強度、粘度和 pH c =溶液中的探針濃度（ mol/L） 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 雜交最適溫度 — 雜交技術最重要的因素之一 反應溫度低于 Tm 10～ 15℃ ，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低（ Tm30℃ ），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱 最適復性溫度 （ Optimunm renaturation temperature, TOR）： Tor =Tm –25℃ 苛刻復性溫度 ： Ts = Tm – (10或 15℃ ) 非苛刻復性溫度 ： Tns =Tm – (30或 35℃ ) 可以通過使用高濃度鹽溶液（如 ），或使用某些有機溶劑的水溶液降低反應溫度 現(xiàn)在認為，適當選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應溫度，可使 DNA復性和 DNARNA雜交獲得高特異性和更快的反應速度。 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 雜交的嚴格性 影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體 Tm值 25℃ 時雜交最佳 。 通過調節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性 在實際應用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶 DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌 DNA）的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結合探針信號很強，而非特異靶序列與探針無任何反應的溫度就是最適溫度 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 雜交反應時間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間 一般雜交反應要進行 20h左右 推薦 用 Cot =值來計算雜交反應時間 Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（ Co）和反應時間（ t）的乘積，實驗表明 Cot =100時，雜交反應基本完成 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 雜交促進劑 惰性多聚體 可用來促進 250個堿基以上的探針的雜交率，對單鏈探針可增加 3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達 100倍 硫酸葡聚糖、聚乙二醇（ PEG）、聚丙烯酸 小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化
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