食品安全快速檢測(cè)技術(shù)7分子雜交技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-01-06 10:14本頁(yè)面
【正文】 酶高 10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，其顯色結(jié)果可長(zhǎng)期保存，但辣根過(guò)氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù) 30分鐘。 5) 雜交結(jié)果 2. 蛋白質(zhì) 的免疫分析 封閉劑 ， 明膠 ， 牛血清蛋白 ， 卵清蛋白等 。 EtB r 雜交 EtB r 雜交雜交結(jié)果示意圖 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 探針的選擇 在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的 DNA或 cDNA雙鏈探針 在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的 DNA單鏈探針或RNA探針 長(zhǎng)的雙鏈 DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交 ? 探針的標(biāo)記方法 選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定； 但還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等 一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高 在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng) 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 探針的濃度 總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加 在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加 膜雜交中 32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為 5～10ng/ml和 25～ 1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為 ～ 受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 雜交率 現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無(wú)論在液相雜交還是固相雜交均在探針過(guò)剩的條件下進(jìn)行 在探針過(guò)量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過(guò)剩單鏈探針對(duì)靶序列雜交的情形 t1/2=ln2/kc t1/2半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間（ s） k =形成雜交體的速率常數(shù) [mol/(Lxntxs)]決定于探針長(zhǎng)度（ L）、探針復(fù)雜度（ N）、溫度、離子強(qiáng)度、粘度和 pH c =溶液中的探針濃度（ mol/L） 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 雜交最適溫度 — 雜交技術(shù)最重要的因素之一 反應(yīng)溫度低于 Tm 10～ 15℃ ，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（ Tm30℃ ），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱 最適復(fù)性溫度 （ Optimunm renaturation temperature, TOR）： Tor =Tm –25℃ 苛刻復(fù)性溫度 ： Ts = Tm – (10或 15℃ ) 非苛刻復(fù)性溫度 ： Tns =Tm – (30或 35℃ ) 可以通過(guò)使用高濃度鹽溶液（如 ），或使用某些有機(jī)溶劑的水溶液降低反應(yīng)溫度 現(xiàn)在認(rèn)為，適當(dāng)選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應(yīng)溫度，可使 DNA復(fù)性和 DNARNA雜交獲得高特異性和更快的反應(yīng)速度。 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 雜交的嚴(yán)格性 影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體 Tm值 25℃ 時(shí)雜交最佳 。 通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來(lái)控制所需的嚴(yán)格性 在實(shí)際應(yīng)用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶 DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌 DNA）的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結(jié)合探針信號(hào)很強(qiáng)，而非特異靶序列與探針無(wú)任何反應(yīng)的溫度就是最適溫度 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 雜交反應(yīng)時(shí)間 在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間 一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行 20h左右 推薦 用 Cot =值來(lái)計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間 Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（ Co）和反應(yīng)時(shí)間（ t）的乘積，實(shí)驗(yàn)表明 Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化 ? 雜交促進(jìn)劑 惰性多聚體 可用來(lái)促進(jìn) 250個(gè)堿基以上的探針的雜交率，對(duì)單鏈探針可增加 3倍，而對(duì)雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá) 100倍 硫酸葡聚糖、聚乙二醇（ PEG）、聚丙烯酸 小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化
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