食品安全快速檢測技術(shù)7分子雜交技術(shù)(參考版)
2025-01-09 10:14本頁面
【正文】 最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶 DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌 DNA）的膜。一般認(rèn)為在低于雜交體 Tm值 25℃ 時雜交最佳 。若反應(yīng)溫度再低（ Tm30℃ ），雖然互補鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱 最適復(fù)性溫度 （ Optimunm renaturation temperature, TOR）： Tor =Tm –25℃ 苛刻復(fù)性溫度 ： Ts = Tm – (10或 15℃ ) 非苛刻復(fù)性溫度 ： Tns =Tm – (30或 35℃ ) 可以通過使用高濃度鹽溶液（如 ），或使用某些有機溶劑的水溶液降低反應(yīng)溫度 現(xiàn)在認(rèn)為，適當(dāng)選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應(yīng)溫度，可使 DNA復(fù)性和 DNARNA雜交獲得高特異性和更快的反應(yīng)速度。 EtB r 雜交 EtB r 雜交雜交結(jié)果示意圖 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 探針的選擇 在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的 DNA或 cDNA雙鏈探針 在檢測單鏈靶序列時應(yīng)選用與其互補的 DNA單鏈探針或RNA探針 長的雙鏈 DNA探針特異性較強，適宜檢測復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交 ? 探針的標(biāo)記方法 選擇什么標(biāo)記方法主要視個人的習(xí)慣和可利用條件而定； 但還應(yīng)考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等 一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高 在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng) 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 探針的濃度 總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加 在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加 膜雜交中 32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為 5～10ng/ml和 25～ 1000ng/ml，而原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為 ～ 受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響 六、核酸分子雜交實驗因素的優(yōu)化 ? 雜交率 現(xiàn)代雜交實驗無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進行 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復(fù)雜度）和探針濃度。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個小時，其顯色結(jié)果可長期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù) 30分鐘。 ii. 堿性磷酸酶 的作用底物是 5溴 4氯 3吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應(yīng)中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。 4）放射自顯影或顯色反應(yīng) 使用放射性同位素標(biāo)記物，采用放射自顯影。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計算： T=4GC+2AT * 高強度與低強度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強度雜交條件；若使低同源性 DNA之間雜交，則采用低強度雜交條件。 返回 1. 核酸 雜交步驟與結(jié)果檢測 1） 預(yù)雜交： 預(yù)雜交液中常加入鮭魚精 DNA，若標(biāo)記探針是 cDNA或 RNA，預(yù)雜交液中還需加入多聚 A以阻止特異性結(jié)合 , 42℃ 46h或過夜。在 Klenow的催化下，以引物 3’端為起點，沿模板 3’ → 5 ’方向合成 DNA新鏈。 Klenow具有 5’→ 3 ’聚合酶活性。 DNA聚合酶 I的兩種作用交替進行，探針即被標(biāo)記。 下一節(jié) 雙鏈 DNA標(biāo)記法一 切口移位法 （ Nick Translation） ? 原理及過程： 反應(yīng)體系中 DNA酶 I隨機在探針 DNA上打開缺口，然后利用 DNA聚合酶 I 5’ → 3 ’外切酶活性，在缺口處按 5’→ 3 ’方向切除單核苷酸；在切除的同時 DNA聚合酶 I有 5’ → 3 ’的聚合酶活性，在缺口處 3’端鏈接底物中的單核苷酸，彌補缺口處的核苷酸鏈。 539。 3 39。 539。 3 39。 539。 339。 539。 339。 539。 339。 iv. 效率 非放射性標(biāo)記所需時間短 。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在 4℃ 保存一年 ， 放射性標(biāo)記需每次制備 。 可作用于大多數(shù)哺乳動物的 IgG（ 免疫球蛋白 ） ， 靈敏度較低 （ 5ng） iii) 免疫金 （ immunogold） 3) 兩類標(biāo)記化合物的比較
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1