【正文】 存于同一細(xì)胞中。 洗滌的條件： 如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時(shí)間因核酸探針的類型和標(biāo)記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。 （ 3）雜交的溫度和時(shí)間 雜交溫度： DNA或 RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。 雜交注意環(huán)節(jié) （ 1）探針的濃度 原則 :探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信 /噪比值。 ④ 消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出 時(shí)空氣污染。 優(yōu)點(diǎn) : 通過去蛋白作用增強(qiáng)組織通透性和探針的穿透性 ,提高雜交信號(hào) . 缺點(diǎn) : 減低 RNA的保存 ,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài) .因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。 多聚甲醛 —— mRNA的定位 將組織固定于 4%多聚甲醛磷酸緩沖液中 1～ 2h，在冷凍前浸入 15%蔗糖溶液中，置 4℃ 冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。 固相雜交技術(shù)包括： ① 菌落原位雜交 ② 斑點(diǎn)雜交法 ③ Southern印跡雜交 ④ Northern印跡雜交 ⑤ 組織原位雜交 （二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展 在近 20年飛躍發(fā)展的突出特點(diǎn)： ① 由分子遺傳學(xué)研究提供的探針大量增加； ② 探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了； ③ 非放射性標(biāo)記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應(yīng)用的診斷技術(shù)。 液相分子雜交技術(shù)包括： ① 吸附雜交 ② 發(fā)光液相雜交 ③ 液相夾心雜交 ④ 復(fù)性速率液相分子雜交 ? 固相雜交： 是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜 ， 其它如尼龍膜 、 乳膠顆粒和微孔板等 ） ， 另一條參加反應(yīng)的核酸鏈游離在溶液中 。 多聚甲醛： 仍被公認(rèn)為 ISHH較為理想的固定劑。 常用方法： 稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑 Triton X100、酒精或某些消化酶等。 ③ 要破壞 RNA酶，最低溫度必須在 150℃ 左右。 蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。 200～ 500個(gè)堿基的探針 可應(yīng)用 . 超過 500個(gè)堿基的探針 在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn) 行水解，使其變成短的片段， 達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。 錯(cuò)配對(duì)雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。 目的： 通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對(duì)除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 6 對(duì)照實(shí)驗(yàn)和 ISHH結(jié)果的判斷 ① Northern 和 Southern印跡雜交法。 （二）核酸探針 ?1 核酸探針的種類 ?2 探針的標(biāo)記與應(yīng)用 1 核酸探針的種類 （ 1）按標(biāo)記方式分類 直接法和間接法： １）直接標(biāo)記探針 應(yīng)用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（ FITC）或羅丹明 Rhodamine等熒光物質(zhì)的 dNTP或 NTP直接標(biāo)記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。 BPA反應(yīng)物與 DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應(yīng)，這個(gè)特異性可使 BPA只標(biāo)記粗制細(xì)胞裂解物中的核酸，而不標(biāo)記蛋白、多糖和其他細(xì)胞大分子。 ８ 2 SSC洗 10min。 16 堿性磷酸酶 室溫 1~3h。 反應(yīng)步驟如下： ① 用 PBS沖洗黏附有切片的載玻片。 ⑨ DAB溶液孵育 315min。 地高辛標(biāo)記的核酸探針較穩(wěn)定， 20℃ 儲(chǔ)存可達(dá) 2年，隨時(shí)可以 取用，但在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中，人們?nèi)圆捎眯迈r的地高辛標(biāo)記 36個(gè) 月以內(nèi)的核酸探針。一般不提倡浸入二甲苯溶液，但在細(xì)胞內(nèi) mRNA含量高時(shí)應(yīng)用二甲苯脫蠟后人能顯示。 ④ 。 ② 浸入緩沖液 Ⅰ 中室溫孵育 10min，以封閉非特異性部位。 ⑦ 復(fù)染，可用派咯寧丫 1030s。 :05:5911:05:59March 12, 2023 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國見青山。 11:05:5911:05:5911:05Sunday, March 12, 2023 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 :05:5911:05Mar2312Mar23 1越是無能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)