原位雜交與凋亡檢測技術(shù)-閱讀頁
2025-05-28 00:53本頁面
【正文】 細(xì)胞死亡 （ programmed cell death, PCD） 細(xì)胞自身的一種主動的生理性死亡過程，一種不同于壞死的死亡方式；是由基因控制的細(xì)胞自我消亡過程。 原位末端標(biāo)記凋亡細(xì)胞：可有或無上述特征（早期觀察）。 二、凋亡檢測技術(shù)： 原位細(xì)胞凋亡； 凝膠電泳； 流式細(xì)胞術(shù)； 激光掃描。 （ 1）培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)低速離心（ 250r/min）5分鐘，避免破碎。 染色方法： （ 1）普通 HE染色； （ 2） Giemsa 染色； （ 3） Mayer蘇木素。 （ 2）凋亡小體（嗜酸性小體）：被巨噬細(xì) 胞或上皮細(xì)胞吞噬或游離的凋亡細(xì)胞。 食管鱗癌細(xì)胞系TUNEL染色 食管鱗癌細(xì)胞系石蠟切片 HE染色 （二）熒光顯微鏡下形態(tài)：熒光顯微鏡下凋亡細(xì)胞呈黃色。 染色時間：半小時 ~1小時。 （ 1）透射電鏡：與光鏡基本相同，僅是放大倍數(shù)不同而已，表現(xiàn)如下： ① 凋亡的細(xì)胞皺縮，胞膜完整 , 胞漿致密，細(xì)胞器密集可有不同程度的退變（線粒體腫脹等）。 ③ 胞質(zhì)多發(fā)性芽突，芽突脫落 →→ 凋亡小體（胞膜包繞，其中含有不同程度退變的細(xì)胞器和脂滴、核碎片可有可無）。 （四）凋亡細(xì)胞的原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記：（ TdTmediated dUTP nick end labeling ， TUNEL method） 原理：細(xì)胞凋亡 →→ 細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切 酶被激活 →→ 核染色質(zhì) DNA雙鏈斷裂 →→ 露 出 3’ OH末端 DNA片段 → TDT酶 →→ 與生物素 或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合 →→ 熒光素 /酶鏈 標(biāo)記卵白素 /抗地高辛抗體結(jié)合 →→ 凋亡細(xì)胞 原位顯示。 組織處理： （ 1）新鮮標(biāo)本：人體組織離體后迅速固定，動物實(shí)驗(yàn)可用內(nèi)灌注后處死。 （ 3）固定時間： ① 活組織不超過 24小時，最好在 4小時以內(nèi)。冰凍切片－ 20℃ 保存，時間不超過一月。 Tunel法實(shí)驗(yàn)操作步驟 二甲苯脫蠟， 10分鐘 3次； 經(jīng)梯度酒精至蒸餾水； % NaCl、 PBS各洗 5分鐘； 4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)前固定 15分鐘； 1 PBS()洗 5分鐘 3次 蛋白酶 K消化，室溫下 12min PBS洗 5分鐘 1次 4% 多聚甲醛濕盒內(nèi)后固定 5分鐘 PBS洗 5分鐘 3次 標(biāo)記緩沖液室溫下 10分鐘 1 TdT和 BiodUTP混合液 370C孵育 70分鐘 1 2 SSC 洗 15分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 % H2O2 5分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 SP 室溫 30分鐘 1 PBS洗 5分鐘 3次 1 DAB顯色 30分鐘 1蘇木素復(fù)染、酒精脫水、封片。 甲狀腺癌細(xì)胞核（ +）， TUNEL 肝組織 TUNEL ， AP反應(yīng) 食管鱗癌角化珠凋亡細(xì)胞， TUNEL法。 鼻咽鱗癌細(xì)胞系 TUNEL染色 腦星形細(xì)胞瘤 細(xì)胞核（ +） TUNEL 干燥綜合征淚腺核（+），TUNEL Tunel法染色注意事項： 切片脫蠟務(wù)必干凈； 蛋白酶 K濃度及時間（新舊蠟塊不同）濃度 20181。 （五）、凋亡檢測技術(shù)的應(yīng)用： 某些疾病發(fā)生機(jī)理的研究； 腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的研究； 藥物療效的檢
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