酵母雜交技術(shù)原理及應(yīng)用-閱讀頁
2025-05-30 20:49本頁面
【正文】 DNA 文庫質(zhì)粒 ； (2)含有 目的基因 和下游報告基因的 報告質(zhì)粒 . 首先將 報告質(zhì)粒 整合入酵母基因組 ,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株 。 若存在文庫蛋白與目的基因的相互作用 ,可通過對報告基因的表達將文庫蛋白的基因篩選出來 . 酵母三雜交系統(tǒng)的原理與酵母雙雜交相似，利用了酵母細胞的 GAL4蛋白調(diào)節(jié)目的基因 (半乳糖苷酶基因及 His3基因 )轉(zhuǎn)錄的特點。只要這兩個相對獨立的結(jié)構(gòu)域能夠通過一定的方式在空間上足夠的靠近 (如借助其他分子的相互結(jié)合使其足夠靠近 )，即使它們之間沒有共價結(jié)合也可激活轉(zhuǎn)錄，這為研究蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用提供了可能。在酵母三雜交系統(tǒng)， lexA啟動子調(diào)控下游 LacZ基因和 His3基因的表達，而 lexA啟動子的激活取決于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域能否在空間上相互靠近。 第二個融合蛋白 也由兩部分組成，一部分為能激活 lexA啟動子的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，另一部分為 有待研究的 RNA結(jié)合蛋白“ Y”。一旦“ X”和“ Y”能有相互作用就使得這個復(fù)合物形成一個功能性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而使得下游的 LacZ基因和 His3基因得以表達。通過缺陷培養(yǎng)基及 β半乳糖苷酶的活性的測定就能判斷在酵母菌內(nèi)是否發(fā)生了 RNA“X”和蛋白質(zhì)“ Y”的相互作用。 噬菌體展示技術(shù) 原理 噬菌體展示技術(shù)是將外源 DNA 通過基因工程技術(shù)克隆到適當?shù)氖删w載體上，使外源 DNA 片段對應(yīng)的表達產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。 該技術(shù)的顯著特點是建立了基因型和表現(xiàn)型之間的對應(yīng)關(guān)系。 p Ⅲ 蛋白 位于噬菌體顆粒的一端，有 3 個～ 5 個拷貝，可在 N 端、近 N 端或 N 端與 C 端的柔性連接區(qū)融合外源肽或蛋白質(zhì)。 p Ⅷ 蛋白位于噬菌體顆粒的兩側(cè)，一般在 N 端或近 N 端融合外源序列。但它的拷貝數(shù)多，因此該系統(tǒng)一般用于篩選親和力較低的配體，高拷貝 p Ⅷ 蛋白在疫苗開發(fā)上具有潛在的應(yīng)用價值。 λ噬菌體展示系統(tǒng)是將外源序列插入噬菌體頭部組裝必需的 D 蛋白的N 端或 C 端， 或 主要尾部蛋白 PV 的羧基端折疊區(qū) (非功能區(qū) ) ，實現(xiàn)外源蛋白的表面展示。 3 T4 噬菌體展示系統(tǒng) T4 噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽 / 蛋白質(zhì)與 T4噬菌體的小外衣殼蛋白 C 端融合而被展示，展示方法是利用一個選擇性載體 (或稱之為整合載體 )，將 融合有外源序列的小外衣殼蛋白 ( small outer capsid protein ,SOC) 融合基因同源整合入缺失 SOC 的 T4 基因組中，選擇恢復(fù)溶菌酶生長不依賴性的噬菌體，即可將外源肽 / 蛋白質(zhì)展示于噬菌體表面。方法是將 SOC 及其融合衍生物在大腸埃希菌中表達，然后分離該融合蛋白，純化后，加入到缺失 SOC 的噬菌體顆?；蚨嗑垲^部，結(jié)合后即可達到展示目的。 4 T7 噬菌體展示系統(tǒng) T7 噬菌體衣殼蛋白通常有兩種形式，即 10A (344 個氨基酸 ) 和10B (397 個氨基酸 ) ，獨特的 10B衣殼蛋白區(qū)存在于噬菌體表面，所以被用作噬菌體展示。 T7 噬菌體展示系統(tǒng)可以在其表面以高、中、低拷貝表達各種蛋白。 T7 噬菌體展示系統(tǒng)是通過 C 端融合表達蛋白，插入片段被克隆到 T7 噬菌體載體基因 10 的 C 端。 關(guān)于實驗 溶液 1 ：由 葡萄糖， EDTA 和 。防止 DNA酶對質(zhì)粒的降解， Tris能是溶菌液維持溶菌作用的最適 ph范圍。 SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性， NaoH的作用是破壞氫鍵，使 DNA變性 溶液 3：由 KAc與 HAc組成，是 ph為 。 K+離子會與 SDS形成溶解度很低的鹽并與蛋白質(zhì)形成沉淀而除去。很容易與小分子的質(zhì)粒 DNA分離。
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