核酸分子雜交技術(shù)ppt課件-閱讀頁(yè)
2025-05-16 01:09本頁(yè)面
【正文】 ? 雜交：?jiǎn)捂?DNA探針與待測(cè) RNA在液相中雜交 ? 核酸酶 S1除去單鏈 DNA和單鏈 RNA ? 電泳分離 DNA/RNA雜交體分子 ? 放射自顯影檢測(cè)雜交結(jié)果 第三節(jié) 探針的標(biāo)記 一、探針的種類(lèi) ? 基因組 DNA探針 ? cDNA探針 ? RNA探針 ? 寡核苷酸探針 二、標(biāo)記物 （一）理想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性： ? 高度靈敏性 ? 不影響堿基配對(duì)的特異性 ? 不影響探針?lè)肿拥闹饕砘再|(zhì) ? 對(duì)酶促反應(yīng)活性無(wú)影響或影響不大 ? 檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性 (二 ) 標(biāo)記物種類(lèi) ? 核素標(biāo)記物： 32p、 35s、 3H ? 非核素標(biāo)記物 半抗原：生物素、地高率 配體：生物素是親和素的配體 熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等 化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光， 如生物素?；膲A性磷酸酶 可使發(fā)光底物發(fā)光 三、標(biāo)記方法 體內(nèi)標(biāo)記法： 將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使 核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?3H胸苷可摻入到 DNA中， 3H尿苷可摻入到 RNA中 體外標(biāo)記法： 化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與 探針?lè)肿由系哪承┗蚍磻?yīng)， 標(biāo)記物直接結(jié)合到探針?lè)肿由? 酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然 后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸 摻入到探針上 酶促標(biāo)記法 （一）切口平移法（ nick translation) 利用 DNase I在 DNA雙鏈上造成單鏈切口 利用大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 5??3?核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從 5?末端逐步切除 在 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合酶催化下，以互補(bǔ)的 DNA單鏈為模板依次將 dNTP連接到切口的 3?末端 OH上，合成新的 DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的 DNA鏈中 （二）隨機(jī)引物法 其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈 DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在 DNA聚合酶的催化下，按 5??3?方向合成一新的 DNA鏈，其核苷酸序列與模板 DNA完全互補(bǔ)。合成時(shí)，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中 隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點(diǎn)： 能進(jìn)行雙鏈 DNA、單鏈 DNA或 RNA探針的標(biāo)記 操作簡(jiǎn)單方便，避免因 DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來(lái)的一系列問(wèn)題 標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá) 108cpm
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