【正文】 30% H2O2 5μl 配置方法 ： 先將 AEC溶于 DMF中 ， 再加入醋酸緩沖液充分混勻過濾 。 將洗滌后的切片浸入顯色液中 51020min， 應(yīng)閉光下反應(yīng) ， 并隨時在顯微鏡下觀察結(jié)果 ， 隨時終止反應(yīng) ， 也可使用商品化的即用型 DAB。 17． DAB顯色或 AEC顯色 ， 或堿性磷酸酶標(biāo)記的 NBT顯色 。 ? 染色步驟簡便 ， 在一抗反應(yīng)后 ， 切片經(jīng) PBS洗滌后即可加入 EnVison?系統(tǒng)試劑 ， 再經(jīng) PBS洗滌后 ， 可進(jìn)行顯色 。 (2) SABC的特點 ? 高敏感性； ? 低背景； ? 簡便快速； ? 結(jié)果穩(wěn)定 ? EnVison?系統(tǒng)染色原理 ? 與 ABC法 、 SP法及 SABC法的染色原理均不同 ， 是將二抗與多聚螯合物酶 （ HRP或 AP） 通過化學(xué)方法連接在一起 ， 形成多聚螯合物 ， 在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗 ， 因此 ， 比 ABC法 、 SP法和 SABC法具有更顯著的放大作用 ， 可高出幾十倍 。 這種復(fù)合物中至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位點 ， 可以和各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合 。 與親和素相比是一種更近于完美的生物素結(jié)合蛋白 。 Biotinylated second antibody PO PO PO PO Antigen Biotin Avidin HRP Primary antibody Illustration of ABC method Avidinbiotinperoxidase plex Ag Ag Biotin Streptavidin Enzyme: HRP or AP Primary antibody Biotinylated secondary antibody Illustration of SP method SP plex ? SABC 法的染色原理及特點 (1) 基本原理 鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì) ，分子量 60kD， 不含糖鏈 ， 等電點 PI 。 在使用前半小時 ， 將兩種試劑按說明書要求相互混合 ， 形成復(fù)合物 ， 一般是在 5ml 的 PBS中加一滴 A試劑 (約 50?l)， 混勻后再加一滴 B試劑 (約 50?l)， 混勻 ， 半小時后加至經(jīng)過生物素標(biāo)記的二抗孵育的切片上 ， 室溫下保濕盒內(nèi)孵育 3060 分鐘 。 根據(jù)上述這些抗生物素 生物素的反應(yīng)原理和特性 ， 1981年許世明設(shè)計出了免疫組織化學(xué)染色的 ABC法 （ avidinbiotin peroxidase plex method， ABC ） ， 并已制成了商品化的試劑盒 。 生物素的另一特點是它可以和抗體 IgG的 Fc段結(jié)合 ， 不影響 IgG的活性 。 研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點 ， 提出了卵白素 生物素免疫染色系統(tǒng) 。 卵白素具有 4個同 Vitamin H（ 生物素 ） 親和力極高的結(jié)合點 。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) ， 在雞蛋白中含有一種堿性蛋白 ， 分子量為 68 kD， 屬于糖蛋白 ， 當(dāng)時命名為 卵白素（ avidin） 。濃縮型者一般用 PBS直接以 1: 200 400倍稀釋使用 ， 室溫下保濕盒內(nèi)孵育 3060min。 二抗分濃縮型和即用型兩種 。 13． 用針對一抗的生物素化二抗孵育切片 根據(jù)一抗的種屬來源 ， 選擇相應(yīng)的二抗 。 如果待檢的抗原量很少 ， 而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色 ， 可增加一抗的稀釋倍數(shù) ， 將切片放在保濕盒中置于 4℃ 冰箱內(nèi)過夜孵育 ， 可達(dá)到滿意的效果 。 經(jīng)過正常二抗同種動物非免疫血清孵育后的切片不能用 PBS洗滌 ， 在去除多余的非免疫血清后 ， 直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體 。 一抗稀釋滴度的評價 （摸索實驗條件時可以稀釋度跨度大一些試） 切片編號 slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5 抗體稀釋度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 特異性染色 + + + + + + + + + + + + + + + 背景染色 + + + + + – – ③ 一抗體的稀釋 一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同 ， 即 PBS pH ， 為進(jìn)一步保證減少背景染色 ， 用于稀釋一抗的 PBS中也應(yīng)加入制備二抗的同種動物的非免疫正常血清 ， 有條件的還可加入 BSA， 兩者的濃度在 125% 即可 。 ? 在免疫組化染色中 ， 使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋 ，直接在切片上滴加即可 。 ? 國外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是 100200?g/ml， 但國內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)行了分裝 ， 如分成 ，也經(jīng)銷 1ml/瓶抗體 ， 價格各不相同 。 根據(jù)實驗動物或標(biāo)本種屬的不同 ， 選擇針對大鼠 、 小鼠或人的抗體 。 ① 一抗的種屬來源 一抗可來源于各種種屬的動物 ， 常見是來自家兔 、 山羊或小鼠 ， 偶見來自馬 。 11． 用特異性一抗孵育切片 研究組織細(xì)胞中的某種抗原是否存在 ， 應(yīng)用免疫組化染色 ， 就要選用針對這種抗原的特異性抗體 。 ? 非免疫血清的稀釋度 1:5~1:20， 還可加入 BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非免疫血清中含 ~6%的BSA， 可取得更佳的染色效果 ， 阻止非特異性背景染色 。 ? 最常見的原因是蛋白 (第一抗體 ) 吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上 。 10. 用與制備二抗相同的動物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附 。 以上三種酶消化液 ，以第一種最為常用 。 消化時間應(yīng)根據(jù)不同組織而異 。 ③ % 蛋白酶 K 蛋白酶 K g () 100 ml 用法同上 。 。 ① % 胰蛋白酶 胰蛋白酶 % 氯化鈣 (pH ) 100 ml 配制方法： 先配制 %的 CaCl2， 用 NaOH將其 pH調(diào)至 ， 然后加入胰蛋白酶 ，溶解之 。 蛋白酶的消化時間 5~10~20min，視切片固定時間的長短而定 。 胃蛋白酶 ：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測切片的消化 ， 如纖連蛋白 (fibronectin)， 各型膠原等 。 ? 注意事項： 用于 IHC切片消化的酶有多種 ， 所選擇酶的種類 、 使用的濃度 、 pH值 、 消化時間及溫度等均要視組織固定的不同 、 所檢測抗原的性質(zhì) 、組織類型的不同而異 ， 通過預(yù)實驗確定 。 ⑥ 如果在常用的緩沖 （ 修復(fù) ） 液中無法實現(xiàn)抗原修復(fù) ，得不出好的染色結(jié)果 ， 或經(jīng)修復(fù)后 ， 抗原定位發(fā)生改變 ，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑 ， 如 EDTA或EGTA等可能取得較好的效果 。 ④ 一批抗原的檢測其溫度和時間應(yīng)保持一致 。 ② 不能煮干修復(fù)液 。 ? 最佳修復(fù)方法的選擇 選擇最佳的修復(fù)方法設(shè)計表 檸檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 1011 TrisHCl Buffer pH 12 pH 78 pH 1011 微波 100℃ 10min 2 slide 1 slide 2 slide 3 壓力鍋 120℃ 10min slide 4 slide 5 slide 6 微波或水浴 90℃ 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作對照 ， 不作任何處理 ? 抗原熱修復(fù)應(yīng)注意的問題 有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應(yīng) ，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示 ， 對某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原 ， 經(jīng)修復(fù)后 ， 絕大部分表達(dá)在核內(nèi) 。 ③ 壓力鍋法： 不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液 ， 加熱鍋使液體煮沸 ， 將切片加入切片架并置入鍋內(nèi) ， 蓋上鍋蓋 ， 不加閥 ， 開始冒氣計時 50 min， 關(guān)閉氣閥 ， 使之加壓 10 min。 ?溫度與修復(fù)時間的關(guān)系： 許多的實驗結(jié)果表明：溫度高修復(fù)時間短 ， 如 Ki67和 Pgp的檢測 ， 利用同一切片 ， 達(dá)到相同染色結(jié)果需要： ① 100℃ 20min； ② 90℃ 30min； ③ 80℃ 50min； ④ 70℃ 20h ? 操作流程 ① 微波處理： 將切片插入 25 片塑料架上 ， 在 250 ml塑盒內(nèi)加入 200 ml緩沖液 ， 將微波高檔加溫緩沖液至 90℃ +， 取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗 ， PBS洗 。 （ 1）抗原熱修復(fù) ? 方 法 ① 微波中 96℃ 10~20 min ② 直接加熱法 100℃ 10 min ③ 高壓鍋 / 消毒鍋 120℃ 10 min ? 其他：水浴鍋 100℃ 10 min 2 及真空加熱 10 min 等。 目前機理清楚 ， 但是以高溫 、 高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗表明 ， 可以提高抗原抗體陽性檢測率 ， 同時也會出現(xiàn)假陽性 ， 現(xiàn)已廣泛用于技術(shù)中 。 8． 抗原修復(fù) （ antigen retrieval, AR） 某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色 ， 如橫紋肌中的 myoglobin (Mb)、 actin、 myosin、 腦組織中的S100蛋白 、 GFAP、 血型抗原 A、 B、 H、 生長激素 (growth h o r m o n e )、 胰島素 、 波形蛋白 ( v i m e n t i n )、 降鈣素(calcitonin)等 。 ? (~) 的配制： NaH2PO4 2H2O g Na2HPO4 12H2O NaCl 蒸餾水 加至 1000 ml ?為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色 ， 可在PBS中加入 Tween 20， 制成含 % Tween 20 的 PBS。 6． 清除內(nèi)源性過氧化物酶活性 由于常規(guī)免疫組織化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和DAB (3, 3diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而組織中常含有內(nèi)源性過氧化物酶 ， 為防止出現(xiàn)假陽性反應(yīng)和減少背景染色 ， 需要先清除內(nèi)源性過氧化物酶活性 。C 過夜，干燥。 ? 撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。 ? 切片厚度： 57?m。 粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復(fù)或酶消化后，有時易脫片。 ?甲醛 甘油明膠 ? 試劑： 40%甲醛 ，明膠 ，蒸餾水加至 100ml。 ? 涂片前將其稀釋 1050倍 ， 均勻涂在處理后干凈的載玻 片上 ， 37 186。C 或 20 186。 ? 多聚賴氨酸（ PolyLlysine， PLL） ? 試劑配制： PLL + 蒸餾水 100 ml 也可根據(jù)提供的方法配制 。 具體操作方法 ： ? 將載玻片用酸處理后 ， 用 95%酒精浸泡 ， 再用綢布擦干 ， 清除表面的污漬； ? 將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi) 5min； ? 將載玻片用鑷子夾住浸入 APES試劑（ 1ml