酶組織化學(xué)ppt課件-文庫吧資料
2025-01-11 20:14本頁面
【正文】 苷酸酶、 G— 6— P酶 。 分布于腎近曲小管細(xì)胞核周圍，肝細(xì)胞毛細(xì)膽管周圍均有棕黑色顆粒 對照： 孵育液內(nèi)加 NaF 去底物實驗 ? 腎小管上皮細(xì)胞 注意事項 ① 鉛離子的濃度 是關(guān)鍵問題，沒有底物，有些組織吸附鉛離子（ +），因此必須用NaF抑制酶活性 → 排除假陽性反應(yīng)。 （可用蘇木精復(fù)染核） ⑤ 用甘油明膠或 Apathy氏糖膠封固。（溫蒸餾水洗） ③ 入 5％ 硫化胺 ， 1～ 2分鐘。 ③ 該酶活性高的器官：腎、肝、腸、脾、腎上腺。 ※ ACP的特性 ① PH ～ ② 激活劑： Mn2+ ③ 抑制劑： NaF，有些 ACP為 Cu2+、 酒石 酸鹽、四氧嘧啶甲醛等抑制劑。 酸性磷酸酶 —— 硝酸鉛法 ? 要求： 在底物溶液中的 H＋濃度為弱酸性的條件 ? 常用 硝酸鉛 或 醋酸鉛 ? 應(yīng)用： 酸性磷酸酶和在中性附近其作用的磷酸酯酶類。 ? 如： 酸性磷酸酶 —— 鉛法 鉛法 —— 顯示酸性磷酸酶 (ACP) 〔 原理 〕 以 β — 甘油磷酸鈉 為底物，在 酸性 PH下，被 ACP水解，釋放出磷酸鹽，遇鉛離子則生成 磷酸鉛 沉淀。 ③ 加抑制劑 ，左旋咪唑 ～ 注意事項 ① 〔 Ca2+〕 要足量 ② 用水將鈷離子洗凈，以防止出現(xiàn)假陽性 ③ 有些組織中有色素（含鐵血黃素、黑色 素）出現(xiàn)，可影響結(jié)果。 評價： 此法反應(yīng)產(chǎn)物可發(fā)生擴(kuò)散， 定位欠準(zhǔn)確 ； 腎曲管堿性磷酸酶 鈣鈷法 X100 腎曲管堿性磷酸酶 鈣鈷法 X200 ? 大鼠小腸絨毛吸收細(xì)胞呈深棕色 對照 ① 無底物孵育 ，以蒸餾水代替孵育液中的 3％ β — 甘油磷酸鈉，其余各步進(jìn)行同上。 ⑦ 入 Mayer氏蘇木精染液 (復(fù)染核 )1分鐘 ⑧ 流水洗 5分鐘 → 蒸餾水。 ⑤ 入 ， 2分鐘。 固定： 丙酮 ∶ 氯仿（ 1∶1 ）混合液。 ? 局限性： 是要求 PRP停留原位不發(fā)生彌散。 堿性磷酸酶（ AKP） —— 鈣鈷法 〔 原理 〕 以天然存在的 β — 甘油磷酸鈉 為底物，經(jīng)酶水解釋放出磷酸，立即被鈣離子沉淀為磷酸鈣，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產(chǎn)物為黑色的 硫化鈷 沉淀。 缺點： 金屬鹽的移動、擴(kuò)散和吸附現(xiàn)象 一般用于顯示 磷酸酶。 5. 孵育反應(yīng) B. 孵育的溫度和時間 : 37℃ 15 30min C. 切片孵育法 切片孵育 漂浮孵育 6. 酶特異性對照實驗 用酶活性 抑制劑 采用 無底物 的孵育液 過固定或加熱 用針對目標(biāo)酶的 激活劑 改變孵育液 底物 選擇 PH 酶細(xì)胞內(nèi)的 定位差異 對結(jié)果的分析應(yīng)考慮的問題 ? 經(jīng)過凍結(jié)和固定后，酶究竟能保存多少？ ? 酶是否在原位？ ? 反應(yīng)中酶起了多少作用？ ? 酶的活性是否代表了細(xì)胞生活時的狀態(tài)？ ? 沉淀的產(chǎn)物是否能代表酶本身，時間延長，會不會改變？有沒有擴(kuò)散移位？ 顯示酶的組織化學(xué)方法 一、金屬離子沉淀法 （金屬－金屬鹽法） 金、銀、銅、鐵、鋁、鈷 等金屬 利用某些金屬本身具有顏色或其化合物具有顏色（硫化鈷，黑色；硫化鉛，棕黑色等） ? 原理： 以酶作用于底物時，分解產(chǎn)物與底物混合液中的某種物質(zhì)結(jié)合，沉著在作用的局部，接著用金屬置換結(jié)合物質(zhì)，通過金屬顯色來證明酶的反應(yīng)。 ⑷ 防止污染 ， 過 濾 為佳 。 ⑵ 現(xiàn)用現(xiàn)配 ， 保持新 鮮 。 ) 一般原則 輔助物 不影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性 , 不影響其他反應(yīng)試劑的穿透性 ,FRP為水不溶性的有色穩(wěn)定產(chǎn)物 不能與其他成分吸附 或結(jié)合 (五 ) 酶組織化學(xué)的主要步驟 固定或不固定的標(biāo)本 切片 (冷凍或不冷凍 ) 孵育 顯色 顯微鏡下觀察 （六）各步驟注意問題 1. 檢測方法
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