【正文】 或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體 ， 多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體 。 ?ALP標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過氧化物酶含量較高的血細(xì)胞 、 淋巴細(xì)胞等的 ICC染色 。 ? 抗原在組織中的分布不均一 ， 故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)考慮切取主要病灶 。 一般標(biāo)本體積不宜過大 ， 防止固定不透 ， 影響抗原的保存 ， 也浪費試劑 。 固定原理： 甲醛通過使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端 接自來水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)? 組織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。 70% 80% 90% 95% 100% 100% （ 2）透明 ? 為使石蠟?zāi)芙虢M織塊 ， 組織經(jīng)脫水后 ， 必須經(jīng)過一種既能與酒精相溶 ， 又能溶解與石蠟的溶劑 。 （ 4）包埋 浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。C 保存?zhèn)溆?， 可反復(fù)凍存 ， 效果無明顯影響 。 ? 展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展 開切片（水浴鍋上加熱平皿）。Tween 20 為一種除污劑 ， 可清除和封閉組織中的靜電荷 。 ② 水浴鍋法： 一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法 ， 首先調(diào)節(jié)水溫達 95℃ 左右 ， 將切片置入內(nèi)含 200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi) ，放入水浴鍋 ， 溫度平衡后開始計算時間 20 min， 取出容器后自然冷卻到室溫 。 ⑤ 一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無明顯的破壞 ， 但對細(xì)胞核的影響較大 ， 會出現(xiàn)核破裂 ， 蘇木素淡染現(xiàn)象 。 （ 3） 酶消化液的配制 除了商業(yè)銷售的成品 ， 可按說明書使用外 ， 還可自行配制 。 總之 ， 在保持組織形態(tài)不破壞的前提下 ， 宜盡量消化時間延長 。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法 。 ? 國內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進口抗體進行稀釋 ， 銷售的品種又分為 即用型 和 濃縮型 (進口原裝的抗體 )兩種 。 12． PBS洗滌切片 將用一抗孵育后的切片用 PBST洗滌 3次 ， 每次 5min， 用冷 PBS洗滌 ， 可減少非特異性反應(yīng) 。 機體中還有一種物質(zhì)叫維生素 H， 又稱為 生物素 （ biotin） ， 是一種小分子的維生素 ， 廣泛分布于動植物組織中 ， 以輔酶的形式參與各種羥化酶反應(yīng) ， 分子量為 244 D。 ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動物的非免疫血清 、 生物素標(biāo)記的二抗外 ， 還包括： A試劑 (抗生物素 ) 和 B試劑 (生物素 過氧化物酶復(fù)合物 )。 這種復(fù)合物即是 SABC (strept avidinbiotin plex)。 陽性反應(yīng)部分為棕色 ， 經(jīng)核復(fù)染后 ， 脫水 、透明 、 樹膠封片 ， 但由于有致癌作用 ， 配置時應(yīng)注意防護 。 18. 自來水洗滌切片 、 核復(fù)染 、 脫水 、 透明 、 樹膠封片 經(jīng)顯色后 ， 將切片放入自來水中 ， 流水輕沖洗 10分鐘 ， 再經(jīng)蒸餾水洗后 ， 放入蘇木素中做核復(fù)染 （ 顯色切片 ） 20s1min， 經(jīng)酒精 HCl分化后 ，在放入自來水中繼續(xù)分化細(xì)胞核至滿意為止 。 二 、 陰性對照 用確知不存在待檢抗原的組織切片染色 ， 結(jié)果為陰性 。陰性反應(yīng)與陰性結(jié)構(gòu)同在一個視野中 ， 相互印證 ， 這本身就是對陽性反應(yīng)的特異性對照 。 可能遇到的問題是：后一種免疫染色所用的抗體系統(tǒng)可能與前一種染色所用的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng) ， 從而造成疊加污染 ， 失去雙重染色的準(zhǔn)確性和意義 。 ? 開始第二種染色前 ， 先將切片經(jīng)蒸餾水洗 ， 再用酸性溶液洗脫 。 用于滅活的溶液介質(zhì)一般是檸檬酸緩沖液 （ pH ） ， 滅活的溫度一般是 96℃ 左右 。 由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法 ， 從而提高了敏感性 ， 與直接法相比熒光亮度可增強 3～ 4倍 。 吸收光譜峰值： 346nm ，激發(fā)光譜峰值： 442nm 。 建議購買抗淬滅的封片液 ， 使切片可以保存更久 。 2． 染色方法 可用多種方法進行染色 。 3． 結(jié)果觀察 典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 ：細(xì)胞體積縮小及變形；核濃染及喪失亞形態(tài)結(jié)構(gòu) ， 可見核染色質(zhì)呈新月形 ， 或核碎裂成大小不等的核碎片；在組織切片上可見巨噬細(xì)胞或鄰近的上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞或凋亡小體 。 可根據(jù)需要選用熒光標(biāo)記還是 HRPDAB標(biāo)記 。 （ 細(xì)胞涂片和冰凍切片消化 15min；新鮮石蠟切片 510min；陳舊石蠟切片 1015min） （ 5） 標(biāo)本加標(biāo)記緩沖液 20μl/片 ， 以保持切片濕潤 。 37℃ 反應(yīng) 30min。 Apoptosis and necrosis patterns of DNA detected by electrophoresis Ladder pattern in apoptosis Diffuse pattern in necrosis （五）檢測細(xì)胞膜成分變化的 Annexin V 聯(lián)合 PI法 1. 原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（ phosphatidylserine， PS） 遷移至細(xì)胞膜外測 。 biotinylated antidigoxigenin antibody HRP HRP HRP DIG TdT 3180。 （ 6） TBS洗 2min 3次 。 （ 2） 標(biāo)本的處理 石蠟組織切片在脫蠟和水化后 ， 先用 20μg/ml蛋白酶 K作用 1020min后 ， 再進行其他步驟 。 掃描電鏡下 ， 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如偽足 、 微絨毛等消失 ， 細(xì)胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏 。 4,6 二脒基 2苯基吲哚 ）。 第五節(jié) 細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù) 一 、 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 細(xì)胞表面 ：偽足 、 微絨毛等消失 細(xì)胞體形態(tài) ：細(xì)胞皺縮 、 變形 ， 體積變小 細(xì)胞核 ：染色質(zhì)濃縮 、 早期染色質(zhì)聚集于核膜邊 ， 呈新月形 或環(huán)形 ， 晚期碎裂 細(xì)胞器 ：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整 ， 早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴張 細(xì)胞膜 ：完好 ， 晚期包裹細(xì)胞器或核碎片 ， 形成凋亡小體 在組織中表現(xiàn) ：常常以單個細(xì)胞散在發(fā)生 周圍組織反應(yīng) ：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞 、 上皮細(xì)胞 吞噬 、 降解 ， 不發(fā)生炎癥反應(yīng) 發(fā)生條件 ：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡 ， 多發(fā)生于器官 萎縮 、 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷機制 、 小劑量毒素作 用以及多種病理生理狀態(tài) 二 、 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法 （ 一 ） 凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測 1． 制片 （ 1） 常規(guī)組織學(xué)切片 ， 進行脫蠟和水化 。 間接法： 將兩種或三種來自不同種屬的抗體（ 如抗 A、 抗 B、 抗 C的 IgG抗體 ） 同時或分別孵育切片后 ， 再選用標(biāo)記了可發(fā)出不同顏色熒光另外不同種屬的抗 IgG抗體孵育切片 ， 進行雙重或三重免疫熒光染色 ， 是目前常用的檢測技術(shù) 。 2. Alexa Fluor174。 ◆ 方法： 直接法、間接法。 即先做第一種染色 ， 用第一種底物與已定位的酶反應(yīng)呈色 ， 再進行第二種染色 。 2. 洗脫液： （ 1） 甘氨酸 鹽酸溶液 (pH )： mol/L鹽酸 +%（ ） 甘氨酸溶液 95ml（ 制 ） 。 冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色 冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色也是常用的技術(shù) ， 但一般情況下不用 ， 因為冰凍切片操作較復(fù)雜 ， 不易操作 ， 要求標(biāo)本必須是深低溫快速冷凍 ，標(biāo)本不如石蠟塊易保存等 ， 但優(yōu)點是組織的各種抗原保存好 。 這可證明待檢切片中陽性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致 ， 而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應(yīng)的結(jié)果 。 常用的對照組有以下幾種： 一 、 陽性對照 用已證實含用待測抗原的組織 ， 與待檢標(biāo)本做同樣處理后 ， 進行免疫組化染色 ， 結(jié)果應(yīng)為陽性 ， 稱為陽性對照 。 （ 3） 堿性磷酸酶 （ AKP） 標(biāo)記的 NBT顯色液 預(yù)先配置以下試劑： A 液 ： 5% NBT（ Nitrobluetetrazolium） 稱取 10ml 70% 的 DMF， 充分混合 ， 保存于 4℃ ，也可分裝成小份 ， 20℃ 保存 ， 用前復(fù)至室溫 。 Ag Ag Primary antibody Secondary antibody Enzyme, AP or HRP Illustration of EnVision method 16． PBS洗滌切片 ， 5 min 3。 與親和素相同也有四個生物素結(jié)合點 ， 親和力極高 。 由于習(xí)慣上將維生素 H稱為生物素 ， 為便于理解 ， 我國免疫細(xì)胞化學(xué)作者將卵白素稱為抗生物素或親和素 ， 因此卵白素 生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為 抗生物素 生物素免疫染色法 。 即用型二抗不需稀釋 ， 直接使用 。 ④ 一抗的孵育時間及條件 加入適當(dāng)稀釋的一抗的切片 ， 可在常溫下或 37℃ 下保溫盒內(nèi)孵育 。 一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的 IgG抗體 ， 而來自小鼠的多是單克隆的 IgG抗體 。 ? 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為 非特異性背景染色 。 ② % 胃蛋白酶 胃蛋白酶 400 mg HCl 100 ml 多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化 ， 37℃ 下消化時間約 30 min。 ? 常用的消化酶類： 胰蛋白酶 和 蛋白酶 K：檢測細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化 ， 如 Keratin、 CEA、 GFAP等 。 而有些表達在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會出現(xiàn)在胞漿內(nèi) ， 因此 ， 在使用該方法時一定要小心 ，對結(jié)果的判定也要做出客觀的分析 ， 同時在操作過程中還 注意以下問題： ① 熱處理后應(yīng)自然冷卻切片 。 尤其對原來僅表達在冰凍切片上的抗原 ， 利用后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上 。 5． 石蠟切片的脫臘及水化 ? 脫蠟： 將切片放入 染色筐 中，二甲苯 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 各 15分鐘脫臘， ? 水化： 100%酒精 Ⅰ 、 Ⅱ 中各 10分鐘、 95% ALC 5分鐘、 90% ALC 5分鐘、 80% ALC 5分鐘、 70% ALC 5分鐘，蒸餾水浸洗。 ? 配制方法：用一部分蒸餾水（約 80ml）加熱溶解明 膠 ， 待完全溶化后加入甲醛 ， 最后補充蒸餾水至 100ml，混勻即可。C 過夜，干燥； ? 用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。 （ 3）浸蠟 組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟。 酒精對組織的穿透速度很快 ， 對組織有較明顯的收縮作用 。 （ 2）水洗 ? 沖洗時間與標(biāo)本的種類、組織塊的大小和固定時 間長短有關(guān)。冷卻后用 1N HCl 調(diào) PH 值至 ，再用 PB將溶液加至 1000ml。 手術(shù)切除的組織較新鮮 ， 取材后應(yīng)立即固定 ， 以保存組織結(jié)構(gòu)和抗原 。 （ 4）核復(fù)染 在顯色后 ， 特別是用 DAB顯色后 ，切片可用蘇木素染料進行核復(fù)染 ， 經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍色 ， 與胞質(zhì)中的 DAB棕色形成對比 。 IHC技術(shù)中 ， 絕大多數(shù)以間接法為常用 。 2. 免疫組織化學(xué)染色的顯色原理 (1) 基本原理 熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法 。 抗原具有兩種性能 ： （ 1） 免疫原性 （ immunogenicity） 指抗原分子具有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性 。C 孵育 20 min。 ?