【正文】 潔度有關(guān)。(3)如果顯色液中用1mmol/L左旋咪唑的濃度，仍然發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性磷酸脂的活性較高（背景色）
，左旋咪唑的濃度可以增加到5mmol/L。注意事項(1)顯色液的配制：10ml Buffer B NBT(70％ 二甲基甲酰胺中含有75mg/1ml NBT），35μl BCIP或X磷酸鹽（100％ 二甲基甲酰胺中含有50mg/ml X磷酸鹽）
，1mmol/L左旋咪唑(levamisole)()。(11)用自來水洗210min。(9)ddH2O中止反應(yīng)。(7) 每張切片200μl顯色液，在黑暗條件下顯色224小時。(5)用Buffer B (100mmol/L TrisHcl,100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl2 )孵育切片10 min。(3)抖去封閉液，每張切片加羊抗地高辛抗體AKP結(jié)合物30μl (Buffer ％ Triton X100,1% 正常羊血清, 羊抗地高辛抗體AKP結(jié)合物)在溫盒內(nèi)2小時。(六)雜交后顯色(1)用Buffer A (100mmol/L TrisHcl,150mmol/L NaCl)振蕩漂洗切片210min。注意事項在同一容器中不能同時放入含不同探針切片。(3)為消除未雜交單股cRNA探針，在37℃ 含RNA酶A 的NTE緩沖液(500mmol/L NaCl,10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA,)中漂洗30min。(五)雜交后處理(1)揭去雜交罩將切片浸泡于2SSC中5 10min。(4)置42℃ 濕盒內(nèi)過夜。(2)瀝干后用雜交緩沖液漂洗，并沿組織周
邊擦干，每張切片滴加30μl探針雜交液(內(nèi)含510ng非同位素標(biāo)記cRNA探針)。(四)原位雜交(1)雜交液 (40％ 去離子甲酰胺、10％ 葡聚糖、1Denhardt39。(2)由于醋酸酐極不穩(wěn)定，宜將醋酸酐在使用前加到TEA緩沖液中。(8)在37℃ 孵育切片后，雜交緩沖液沖洗（含50％ 去離子甲酰胺的4SSC），至少10 min。(6)再用DEPC 處理的PBS沖洗切片25min。石蠟切片用TE緩沖液配制的不含RNA酶的520μg/ml蛋白酶K，在37℃ 下通透切片30min。(3)用DEPC處理的PBS漂洗25min。(三)預(yù)雜交(1)切片用DEPC處理的PBS (140mmol/L NaCl ， KCl,10mmol/L Na2HPO4,
mol/L KH2PO4) 孵育25min，再用DEPC處理的含100mmol/L 苷氨酸(Glycine)PBS 孵育切片25min。RNA探針的水解：按以下方法減少探針長度為近200bp，在Microcentrifuge 管內(nèi)加入50μl RNA探針標(biāo)記液，加入30μl 200mmol/L Na2CO3 和20μl 200mmol/L NaHCo3。④真空下干燥RNA沉淀物。②在20℃ 孵育4
16小時。對探針標(biāo)記、預(yù)雜交、雜交和后雜交流程中使用的容器、% DEPC處理，為避免RNA酶污染，操作人員必須戴手套和口罩操作。
用EDTA緩沖液和DEPC處理的ddH2O將會影響RNA多聚酶中的質(zhì)粒。(4)在冰凍切片和石蠟切片制作過程中，所使用的容器、器械都要經(jīng)高壓消毒，或清潔后用0
.1% DEPC水清洗，再經(jīng)ddH2O沖洗，避免外源性RNA酶污染。(2)標(biāo)本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片，這一制備法既能避免mRNA降解，又
能保持良好的組織形態(tài)。(4)切成5μm薄片粘附于涂有粘附劑的載玻片上，在40℃ 恒溫箱內(nèi)過夜干燥切片，用新的二甲苯脫蠟210min和100％、95％、70％、各級酒精15min，ddH2O漂洗25min。(2)
立即投入4% 多聚甲醛溶液內(nèi)(PBS新配制),％ 戊二醛，在室溫下固定34小時。(4)或
將組織塊置于20℃ 恒冷切片機內(nèi)切成10μm薄片，粘附于涂有粘附劑的載玻片上置室溫下
，置40℃ 恒溫箱內(nèi)過夜，或置40℃ 恒溫箱內(nèi)至少2小時，后將切片放入切片盒在80℃ 超
低溫冰箱內(nèi)存放備用。(2)立即投入4％ 多
聚甲醛溶液中（PBS新配制），4℃ 下固定24小時。一般RNA原位雜交采用雜交孵育過夜，在黑暗環(huán)境下進行，可以避
免光線對甲酰胺的電離作用。另外雜交體中GC的百分比，雜交體長度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關(guān)。雜交溫度應(yīng)低于解鏈或融解溫度(melting
temperature Tm)2030℃。保持雜交液不流失的關(guān)鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應(yīng)用雜交罩等也很必要。探針濃度按其種類而略有不同，而非
。 2. 探針的長度原位雜交反應(yīng)中探針濃度應(yīng)超過靶序列的濃度，探針濃度必須給予該實驗最大信噪比，因為
背景著色度高低與探針濃度有關(guān)。(4)小心將乙醇倒出，待試管內(nèi)干燥后再用無菌ddH2O稀釋到10ng/μl濃度。(2)在室溫中加入下列試劑終止水解：3mol/L醋酸鈉，()，(%)。長500個堿基的探針雜交時間約需20個小時左右，如超過500個堿基的RNA探針則在雜交前用有限堿基水解法控制其長度。在常溫下將組織浸泡4
小時，每1小時在真空下吸干10分鐘，再注入新的固定液，共4次，然后用50％ 酒精漂洗2次，每次30min。每次30min。交聯(lián)固定劑能較好保存組織中RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但固定時間過長，也可發(fā)生胞漿和胞核內(nèi)大分子化合物形成交聯(lián)，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。經(jīng)沉淀固定劑固定的組織通透性較好，利于探針穿入，但過長時間固定，可引起RNA降解。常用的化學(xué)固定劑可分為，沉淀固定劑和交聯(lián)固定劑兩類。為防止RNA迅速降解，離體后標(biāo)本應(yīng)立即有效固定。40℃ 烤箱內(nèi)干燥切片2小時后儲存在80℃ 或140℃ 超低溫冰箱內(nèi)備用。次日可將標(biāo)本儲存于80℃ 或140℃ 超低溫冰箱內(nèi)保存。為防止RNA迅速降解，標(biāo)本離體后，應(yīng)迅速投入4％ 多聚甲醛溶液內(nèi)，置4℃ 冰箱內(nèi)2 4小時。多聚左旋賴氨酸溶液的溶度可按實際應(yīng)用效果調(diào)整，并應(yīng)注意有效期限，制備
載玻片應(yīng)盡快使用，防止賴氨酸解聚而失效。將烘烤后的載玻片浸泡硅烷溶液中60min，用雙蒸水漂洗2次，每次10min干燥玻片后，60℃ 烤箱內(nèi)過夜備用。經(jīng)旋渦器反復(fù)攪拌，吸取20－30μl滴加到玻片一側(cè)，再取另一張載玻片復(fù)合，將賴氨酸溶液均勻涂抹在裱組織切片處，并將涂有粘附劑的一面用鉆筆標(biāo)出，室溫下干燥切片后，在60℃烤箱內(nèi)過夜備用。60℃ 烤箱內(nèi)過夜備用。將烘烤后的載玻片浸泡在明膠溶液中10min，在室溫下干燥玻片。為防止組織或細(xì)胞標(biāo)本在雜交過程中漂起或脫落，載玻片應(yīng)涂以粘附劑，大的冰凍或石蠟切
片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標(biāo)本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑。(四)雜交前準(zhǔn)備1. 載玻片和蓋玻片的處理為有效防止外源性RNA酶的污染，雜交用的載玻片和蓋玻片可按以下步驟處理。因為酚雖能有效地變性蛋白質(zhì)，但它不能完
全抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解1015% 的水，從而溶解一部分ploy(A)RNA。乙醇沉淀法的原理
是：DNA可被乙醇沉淀，而未摻入DNA的dNTP則保留在上清液中，由此反復(fù)乙醇沉淀能將兩者分開。這是因為在探針標(biāo)記過程中，反應(yīng)液中仍存在一些未
被結(jié)合到探針中去的剩余dNTP等小分子。近年來間接標(biāo)記法得到較快發(fā)展，先將標(biāo)記物結(jié)合在探針上，通過特異性抗體識別，由特異性抗體結(jié)合多種酶，對檢測的雜交信號作有放大，這一類標(biāo)記法已展示極好的發(fā)展前景。這類標(biāo)記探針必須符合標(biāo)記物在雜交過程中不丟失，又
不影響雜交反應(yīng)為條件。非同位素標(biāo)記法又可分
為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。依標(biāo)記物為同位素和非同位素，近年來非同位素標(biāo)記探針已有了極大的近步。SP6噬菌體的RNA聚合酶對SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉(zhuǎn)錄，在4種三磷酸核糖核苷和相應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉(zhuǎn)錄成RNA。體外轉(zhuǎn)錄常用噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌
體TT7。2. 體外轉(zhuǎn)錄法：體外轉(zhuǎn)錄法是一種制備與克隆片段序列相同的單鏈RNA探針的方法。端或339。1. 酶反應(yīng)法：用于RNA探針的酶反應(yīng)法主要為末端標(biāo)記法與體外轉(zhuǎn)錄法。(二)探針的標(biāo)記在RNA原位雜交中，不僅要選擇適當(dāng)?shù)奶结?，而且還要使探針得到有效的標(biāo)記。由于半衰斯短，性能不穩(wěn)定，污染環(huán)境和危害健康等原因，在RNA原位雜交中應(yīng)用同位素標(biāo)記探針已日趨減少，而非同位素標(biāo)記探針在近年來得到迅速發(fā)展，其標(biāo)記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標(biāo)記等。依標(biāo)記物不同，探針又可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類。合成的寡核苷
酸探針的缺點是：探針長度必須適宜，探針太長可造成內(nèi)部錯誤配對雜交，探針太短可形成
非特異性結(jié)合。由于大多數(shù)寡核苷酸序列較短，不需要純
化，組織穿透性極好。cRNA探針的缺點是：探針的制備過程比較復(fù)雜，需要較好的分子生物學(xué)實驗設(shè)備，它對RNA酶敏感，易受破壞，操作中要謹(jǐn)防RNA酶污染。因此雜交反應(yīng)后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA－RNA雜交體穩(wěn)定。2. cRNA探針：是以cDNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄而獲得的。1. 單鏈cDNA探針： 由于cDNA中不存在內(nèi)含子及其它高度重復(fù)序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應(yīng)中兩條鏈之間復(fù)性的缺點，從而提高了雜交反應(yīng)的敏感性。 二、RNA原位雜交中的探針 (一)探針的種類RNA探針是指帶有標(biāo)記的能與組織內(nèi)相對應(yīng)的核苷酸序列互補結(jié)合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。主要表現(xiàn)在：非同位素標(biāo)記的探針制備和標(biāo)記技術(shù)的進步、雜交信號放大的應(yīng)用、組織預(yù)處理的改進、RNA原位雜交和免疫組化雙重檢測技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡在多重RNA原位雜交中應(yīng)用等。(6)在實驗流程的各個技術(shù)環(huán)節(jié)中熟練運用技術(shù)控制是保證RNA原位雜交成功的必要條件。(3)有較高的靈敏度：在檢出細(xì)胞和組織內(nèi)在低拷貝核苷酸時，RNA原位雜交能獲得較好定位，而DNA原位雜交則難以信任。其次為對外源性基因檢測，以獲得病毒和細(xì)菌類型等病原學(xué)診斷。(2)檢測的目的不同：RNA原位雜交檢測和分析的主要為內(nèi)源性基因，包括細(xì)胞內(nèi)固有基因、異?；蚝妥儺惢颉NA原位雜交不同于DNA原位雜交主要有：(1)使用的探針不同：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，因此避免了應(yīng)用雙鏈DNA探針在雜交反應(yīng)中存在的兩條鏈之間的復(fù)性和第二條鏈的競爭性雜交問題。RNA原位雜交技術(shù)經(jīng)不斷改進，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠超出DNA原位雜交技術(shù)。該技術(shù)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi) RNA表達的一種原位雜交技術(shù)。必須根據(jù)檢測系統(tǒng)不同
的標(biāo)記酶作不同的內(nèi)源酶處理。10%冰醋酸處理組切片10 min,或在底物顯色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止內(nèi)源性堿性磷酸酶的染色。組織細(xì)胞內(nèi)源性酶是原位雜交中非特異性著色的重要原因,目前最常用的酶是過氧化物酶和堿性磷酸酶,這兩種酶都廣泛存在于組織細(xì)胞中,因此用這些酶時應(yīng)有消除內(nèi)源性酶的相應(yīng)步驟。〖HJ1〗(6)非特異性染色非特異性染色可能會來自探針、組織內(nèi)源性酶、組織細(xì)胞、顯色系統(tǒng)等。④省略標(biāo)記探針。②陰性對照:用已知不含待測靶核酸序列的組織作對照。(4)雜交結(jié)果DNA原位核酸分子雜交陽性反應(yīng)為靶基因存在的部位,一般在細(xì)胞核內(nèi),呈紫藍色顆粒狀,若靶基因數(shù)量多或顯色時間長,則整個細(xì)胞核呈濃染藍色,陰性細(xì)胞核呈紅色。現(xiàn)在大多數(shù)的研究都是采用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶與抗半抗原抗體(或抗生物素蛋白)連接進行檢測。注意在漂洗過程中切不要使切片干燥。1SSC 42℃洗2次,每次15 min。(2)雜交后漂洗其目的是去除未參與雜交體形成的過剩探針,消除與組織或細(xì)胞之間的非特異性結(jié)合的探針,
降低背景染色,增加信/噪比。變性完畢將切片放在冰塊上迅速降溫1~2 min,然后將切片移入濕盒內(nèi)置37℃培養(yǎng)箱雜交60 min。探針和靶DNA同時變性,變性的單鏈探針與靶DNA隨即進行雜交反應(yīng)。如果用雙鏈cDNA探針檢測,則探針和靶核酸都必須先解鏈,也就是變性。但過度的蛋白酶消化會引起細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞及靶核酸的減少,也會導(dǎo)致標(biāo)本從載玻片上的脫落。
蛋白酶的濃度及消化時間,視組織種類、固定類型、切片厚度而定,一般使用1 μg/ml蛋白酶K(用含50 mmol/L EDTA的pH80,01 mol/L TrisHCl緩沖液配制),也可用001%蛋白酶BP(用pH80 PE配制)37℃孵育10~30 min。(2)蛋白酶處理 蛋白酶的消化能使固定后被遮掩的靶核酸暴露,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機會。常規(guī)石蠟切片用二甲苯脫蠟3次,每次5 min。3雜交前處理目的在于提高組織的通透性,以防止DNA探針與細(xì)胞、組織之間的非特異結(jié)合，以增強雜交
信號,減少背景著色。置室溫下保存?zhèn)溆谩２僮鲿r要戴手套，要用75%的酒精擦洗工作面和切片刀、鑷子等。2組織切片常用的原位雜交標(biāo)本有石蠟切片、冰凍切片和細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本。玻片硅化方法：(1)室溫下將高溫處理過的載玻片用2% APES丙酮液浸泡3 min；(2)用丙酮洗去多余的APES；(3)用DEPC處理的蒸餾水或高壓消毒的蒸餾水清洗玻片1~2次；(4)40℃烤干玻片，防污保存在干燥器皿中待用。把經(jīng)
過250℃烘烤過的玻片用2% 3氨丙基三乙氧基硅烷(APES)丙酮液處理玻片，有助于組織和載玻片的粘附。將烤干的玻片分別插在染色架中，置250℃烤箱
中烘烤4 h，目的是去除玻片上殘留的核酸酶。1玻片的預(yù)處理組織細(xì)胞原位核酸雜交主要在載玻片上進行，因此玻片的處理至關(guān)重要。6結(jié)果雜交陽性信號呈紫蘭色，細(xì)胞核呈紅或綠色。定時抽查切片，鏡檢其顯色情況。5顯色(1)顯色液配制：在緩沖液Ⅲ 1 ml中加入45 μl四氮唑藍(NBT)，35 μl X磷酸鹽(5溴4氯3吲哚磷酸鹽(BCIP)配成。(7)緩沖液Ⅰ 15 min2，室溫。(5)緩沖液Ⅰ(100 mmol/L TrisHCl,150 mmol/L NaCl pH75)15 min,室溫。(3)05SSC 50℃ 5 min2。
4雜交后漂洗