第十章核酸分子雜交技術(shù)-文庫吧資料
2024-10-13 15:27本頁面
【正文】 移出凝膠而滯留在膜上 （ 2）電轉(zhuǎn)法 利用電場的電泳作用將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。如鮭精 DNA或小牛胸腺 DNA， Denharts溶液或脫脂奶粉 第二節(jié) 核酸分子雜交的方法 按待測核酸是否固定在固相支持物上分： ? 固 液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 ? 液相雜交 RNA酶保護(hù)分析法 核酸酶 S1保護(hù)分析法 一、 Southern印跡雜交 （一）待測核酸樣品的制備 裂解或破碎細(xì)胞 抽取純化基因組 DNA 限制酶消化 DNA為大小不同的 DNA片段 （二）待測 DNA樣品的電泳分離 瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動(dòng)慢 ,小分子 DNA泳動(dòng)快， 大小 相同的分子處于同一條帶 分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng) HindⅢ 消化的 λDNA，雜交 所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記 （三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于 NaOH溶液中使 DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液 （四） Southern印跡 指將電泳分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程 固相支持物的選擇 （ 1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 ①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力 ②不影響與探針的雜交反應(yīng) ③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固 ④具有良好的機(jī)械性能 ?非特異吸附少 （ 2）常用的固相支持物 ①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號本 底低。 復(fù)性過程 （ 1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈 （ 2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時(shí)，雙鏈重新解離 （ 3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列 （ 4）形成完整的雙鏈分子 復(fù)性的速率方程（服從二級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)） dC dt =K2C2 （ 1） 將（ 1）積分 C Co 1 1+K2Cot = （ 2） 一半單鏈 DNA分子復(fù)性時(shí)，（ 2）式中的 為 1 2 1 2 1 1+K2Cot = Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢 C Co （ 3） 1 K2 Cot1/2= 二、影響雜交的因素 核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在 ~,濃度過高
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