核酸分子雜交ppt課件(2)-文庫(kù)吧資料
2025-05-18 04:01本頁(yè)面
【正文】 制備被檢的核酸或蛋白質(zhì)樣品 (或標(biāo)本 ) – 制備雜交探針 – 印跡及雜交 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 ? 常規(guī)設(shè)備 – 移液器， tip頭，離心機(jī) ? RNA電泳 – 金屬浴，水 平凝膠電泳儀，微波爐， 紫外凝膠成像系統(tǒng) ? 紫外分光光度計(jì) ? 轉(zhuǎn)膜過(guò)程 – 3M濾紙，普通濾紙，尼龍膜，托盤(pán)，玻璃板，封口膜， 1000克重物，吸水紙，保鮮膜，手術(shù)刀片，刀柄 ? 預(yù)雜交、雜交 – 水浴搖床，雜交袋，封口器 ? 洗膜、信號(hào)檢測(cè) – 搖床，雜交袋， X光片，暗室，暗盒 實(shí)驗(yàn)試劑 ? RNA提取液（ TSE） ? 100 mmol/L TrisCl ? 20 mmol/L EDTA ? 200 mmol/L NaCl ? 1%SDS ? PVPP 、 β巰基乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇 ? 瓊脂糖、 MOPS、 EB ? 20 SSC: 3 mol/L NaCl， mol/L 檸檬酸鈉（ PH ） ? 鮭精 DNA ? 雜交液： 7% SDS， 50mmol/L Na3PO4（ pH ）， 2% blocking stock solution， 5 SSC， 50％甲酰胺， %Sodium Nlauroyl Sarcoine ? Buffer I: mol/L maleic acid， mol/L NaCl（ pH ） ? Buffer II: 10% blocking stock solution (Antidig) ? Buffer III: mol/L Tris， mol/L NaCl () (CDPstar) ? Washing 1： 2 SSC， % SDS ? Washing 2： SSC， % SDS ? 顯影液、定影液 實(shí)驗(yàn)試劑 ? 轉(zhuǎn)基因煙草葉片 ? 煙草的 NLF基因及標(biāo)記基因 GUS 實(shí)驗(yàn)材料 本部分實(shí)驗(yàn)總流程圖 預(yù)雜交、雜交 RNA提取 1 2 3 4 5 6 7 RNA電泳 轉(zhuǎn)膜 信號(hào)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)步驟－ RNA提取 植物材料 液氮研磨 抽提液 混勻 酚 /氯仿抽提 水層 中間層 有機(jī)層 加入異丙醇沉淀 干燥 水融 反復(fù)抽提 實(shí)驗(yàn)步驟－ RNA提取 ? 向 mL 離心管中加入 700?L RNA提取液， 35181。生物素標(biāo)記檢測(cè)是以 DIGdUTP為底物，用隨機(jī)摻入法進(jìn)行 DNA標(biāo)記， PCR合成標(biāo)記有地高辛的探針，然后加入抗地高辛（ DIG） 堿性磷酸酶 復(fù)合物 AntiDIGAP的抗體，利用堿性磷酸酶和化學(xué)底物作用檢測(cè)到雜交的靶 DNA。 – 多糖、次生代謝物 ? 核酸的保護(hù)（ 內(nèi)源 RNA酶 ） – 低溫、苯酚、氯仿、 SDS可以部分抑制 RNA酶的活性，保護(hù) RNA不被酶解。 – 細(xì)胞 提取液 可溶出核酸。 ? 若經(jīng)雜交，樣品中無(wú)雜交帶出現(xiàn)，表明雖然外源基因已經(jīng)整合到植物細(xì)胞染色體上，但在該取材部位及生理狀態(tài)下該基因并未有效表達(dá)。 ? 將提取的植物總 RNA或 mRNA用變性凝膠電泳分離，不同的 RNA分子 將按分子量大小依次排布在凝膠上，將它們 原位轉(zhuǎn)移到固相膜 上，在適宜的離子強(qiáng)度及溫度下，探針與膜上同源序列雜交，形成 RNADNA雜交雙鏈 。 ? 同時(shí)也
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