《核酸分子雜交》ppt課件 (2)-預(yù)覽頁
【正文】 仿、 SDS可以部分抑制 RNA酶的活性，保護(hù) RNA不被酶解。 3. 加入苯酚 /氯仿 /異戊醇（ 25:24:1）各 350181。 20℃ 放置 20min后 4℃ ， 12022 rpm離心 10 min。L滅菌水中，備用。 實(shí)驗(yàn)步驟 ? RNA電泳 – RNA變性處理 ? 1ul RNA樣品加入 上樣緩沖液，混勻后 65℃ 溫育510min置于冰上冷卻（ 20ul RNA+50ul上樣緩沖液） – 檢測 RNA的凝膠要配制 ? MOPS ? 甲醛 – 電泳緩沖液為 1 M0PS 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 用透明膠帶將膠板的兩端封好。 注意事項(xiàng) ? 特別要注意的是在所有器具嚴(yán)格消毒，實(shí)驗(yàn)過程中需要帶手套，減少說話和走動等防止 RNase的污染，來保證RNA不被降解。 ? 雜交的雙方是待測核酸及探針（ probe） – 待測核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因組 DNA或總 RNA – 被人為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過某種特定方法檢出，即成為所謂的探針。 實(shí)驗(yàn)原理－分子雜交 ? Northern雜交是以 DNA或 RNA為 探針 ，檢測 RNA鏈，用于外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異 mRNA的檢測。 實(shí)驗(yàn)原理－ Northern雜交 實(shí)驗(yàn)原理－ RNA提取 ? 細(xì)胞破碎，核酸溶出 – 液氮速凍后，對植物組織進(jìn)行 研磨 可以破碎細(xì)胞。 ? 探針 – 探針序列需與感興趣的基因互補(bǔ) – 探針需要有熒光或同位素標(biāo)記以利于檢測 – 長度一般為 252022bp的 DNA或 RNA 實(shí)驗(yàn)原理－ 探針制備 gene X PCR probe U 堿性磷酸酶 OPO3 HPO4 O O 目標(biāo) mRNA Spacer Digoxigenin探針 AntiDigoxigenin Antibody Digoxigenin Hapten Alkaline phosphatase CDPStar 不穩(wěn)定中間產(chǎn)物分解發(fā)光 Northern雜交使用了生物素標(biāo)記。L的 β巰基乙醇（終濃度 5%），適量 PVPP。 ? 取上清，加入等體積的氯仿 /異戊醇（ 24:1），搖床震蕩 10min，4℃ 8000rpm離心 10min。 ? 棄上清，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥沉淀。g/ml單鏈RNA，以此來計(jì)算樣品含量。 ? 10 MOPS（ MOPS ， NaAC 50mM， EDTA 10mM， ） ? 待溶液冷卻至 60℃ 左右，加入 1ml甲醛，2ul溴化乙錠充分混勻。g/ml) 。用 15ug樣品進(jìn)行 甲醛變性膠 電泳 (%瓊脂糖凝膠 )，電壓為 50V， 5h，低電壓長時間電泳，使各分子量的 mRNA充分分開。 ? 烘干 ? 轉(zhuǎn)膜過夜后，取出尼龍膜，用鉛筆標(biāo)記上樣孔、編號，臵于 50℃烘干 30min。 ? 雜交 ? 在預(yù)雜交袋中加入變性好的的 探針 5uL，趕氣泡，封袋，50℃ 水浴震蕩過夜。 實(shí)驗(yàn)步驟－信號檢測 注意事項(xiàng) ? RNA提取中要特別注意防止 RNA的降解。 ? 轉(zhuǎn)膜時應(yīng)該使所有的 RNA分子都轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，才能夠保證雜交結(jié)果的準(zhǔn)確性。 ? 嚴(yán)格控制曝光時間以得到清晰的雜交結(jié)果。 ? Northern 雜交時注意哪些問題才能夠得到好的雜交結(jié)果？ 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 雜交結(jié)果 1,CK。 5, 200mM Na2CO3處理 2
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