《核酸分子雜交》ppt課件 (2)(文件)
【正文】 3 4 5 6 7 RNA電泳 轉(zhuǎn)膜 信號(hào)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)步驟－ RNA提取 植物材料 液氮研磨 抽提液 混勻 酚 /氯仿抽提 水層 中間層 有機(jī)層 加入異丙醇沉淀 干燥 水融 反復(fù)抽提 實(shí)驗(yàn)步驟－ RNA提取 ? 向 mL 離心管中加入 700?L RNA提取液， 35181。L，混勻 10min， 4℃ 8000rpm離心 10min。 ? 棄上清， 70%乙醇洗沉淀，離心， 4℃ 12022 rpm離心 5 min。 實(shí)驗(yàn)步驟－ RNA濃度檢測(cè) ? RNA濃度測(cè)定 ? 取 1ul RNA樣品，加水 199ul后讀取 260nm處的吸光度值 ? 260nm處的吸光度值相當(dāng)于 40181。 ? 配制 %的瓊脂糖凝膠（ 于 50ml三角瓶中 ，加入 1 MOPS 20ml） ，在微波爐中加熱至瓊脂糖溶解。 ? 根據(jù)測(cè)定的吸光度 (A260)進(jìn)行濃度的調(diào)整和稀釋（ OD260 40181。 ? 電泳 ? 制備大板膠。用封口膜封邊，放上疊好的吸水紙，壓上約 1000 g的重物。 ? 鮭精 DNA 100℃ ，變性 5min，之后冰上備用 ? 將結(jié)合了 RNA的硝酸纖維素膜臵于雜交袋內(nèi)并加入 5ml預(yù)雜交液， 25ul變性好的鮭精 DNA ，排除袋內(nèi)的氣泡后，封口， 50℃ 恒溫水浴，震蕩 1h。 ? 觀察、分析雜交結(jié)果。 ? 低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳，以保證雜交質(zhì)量。 ? 保證洗膜的質(zhì)量，保證雜質(zhì)的洗脫。 ? 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 4, 200mM Na2CO3處理 12h。 8,天然鹽堿地 End! 。 6, 200mM Na2CO3處理 48h。 2, 200mM Na2CO3處理 2h。 作業(yè) ? 按要求認(rèn)真撰寫報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)用品及藥品、實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 ? 掌握紫外固定的時(shí)間，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成核酸的斷裂。注意器具的消毒，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中帶手套，減少說(shuō)話和走動(dòng)等防止 RNase的污染，來(lái)保證 RNA不被降解。 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)步驟－轉(zhuǎn)膜 實(shí)驗(yàn)步驟－轉(zhuǎn)膜 瓊脂糖凝膠 醋酸纖維素膜 預(yù)雜交 buffer中含有 ‘ blocking reagents’ 能占據(jù)膜上的可結(jié)合位點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)步驟－雜交 實(shí)驗(yàn)步驟－加入抗體 AntiDig 實(shí)驗(yàn)步驟－加入發(fā)光底物 CDPSTAR 實(shí)驗(yàn)步驟－洗膜 ? X光片的曝光 – 將封好的膜放在暗盒中，暗室中在其上放臵好 X光片，蓋好暗盒， X光片曝光 45min。 ? 交聯(lián) ? 短波紫外線固定 30s。紫外凝膠成像檢測(cè)電泳效果。一般調(diào)節(jié)總 RNA的濃度到 1 ug/uL。 ? 放臵合適大小的梳子，將溫?zé)岬沫傊悄z倒入膠模中，凝膠厚度在 35 mm之間，大約需要凝固 20min。 ? 260nm和 280nm讀數(shù)比值（ A260/A280）可反映核酸的純度 ? 純品的 A260/A280的值為 ， ? 低于 A260/A280，有蛋白質(zhì)或酚的污染。 ? 沉淀溶于 20 181。 ? 取上清，加入等體積的異丙醇和 1/2體積的 mol/L NaCl，充分混勻。 ? 取適量材料，在液氮充分研磨成粉末后，裝入離心管中，用力充分混勻。生
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