核酸分子雜交ppt課件(2)-免費閱讀
【正文】 5, 200mM Na2CO3處理 24h。 ? 嚴格控制曝光時間以得到清晰的雜交結(jié)果。 實驗步驟－信號檢測 注意事項 ? RNA提取中要特別注意防止 RNA的降解。 ? 烘干 ? 轉(zhuǎn)膜過夜后，取出尼龍膜，用鉛筆標記上樣孔、編號，臵于 50℃烘干 30min。g/ml) 。g/ml單鏈RNA，以此來計算樣品含量。 ? 取上清，加入等體積的氯仿 /異戊醇（ 24:1），搖床震蕩 10min，4℃ 8000rpm離心 10min。 ? 探針 – 探針序列需與感興趣的基因互補 – 探針需要有熒光或同位素標記以利于檢測 – 長度一般為 252022bp的 DNA或 RNA 實驗原理－ 探針制備 gene X PCR probe U 堿性磷酸酶 OPO3 HPO4 O O 目標 mRNA Spacer Digoxigenin探針 AntiDigoxigenin Antibody Digoxigenin Hapten Alkaline phosphatase CDPStar 不穩(wěn)定中間產(chǎn)物分解發(fā)光 Northern雜交使用了生物素標記。 實驗原理－分子雜交 ? Northern雜交是以 DNA或 RNA為 探針 ，檢測 RNA鏈，用于外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異 mRNA的檢測。 注意事項 ? 特別要注意的是在所有器具嚴格消毒，實驗過程中需要帶手套，減少說話和走動等防止 RNase的污染，來保證RNA不被降解。L滅菌水中，備用。 3. 加入苯酚 /氯仿 /異戊醇（ 25:24:1）各 350181?，F(xiàn)代分子生物學(xué)大實驗 實驗三 總 RNA的提取與 Northern雜交 實驗?zāi)康? ? 掌握植物總 RNA的提取及凝膠電泳檢測的原理及方法并能熟練操作 ? 對于不同的植物組織，選取不同的提取方法，提取植物的總 RNA ? 重點掌握 Northern雜交基本原理、基本實驗步驟和檢測方法 ? 利用 Northern雜交檢測目的基因的時空表達情況，如不同生長發(fā)育階段、不同的組織部位、不同生長環(huán)境等條件下相關(guān)基因的表達情況 植物總 RNA 的提取及電泳檢測 ?掌握植物總 RNA的提取及凝膠電泳檢測的原理 ?掌握植物總 RNA提取的方法并熟練操作 ?用甲醛變性凝膠進行電泳，檢測總 RNA提取質(zhì)量 ?對于不同的植物組織，選取不同的提取方法，提取植物的總 RNA 實驗原理 ? 細胞破碎，核酸溶出 – 液氮速凍后，對植物組織進行 研磨 可以破碎細胞。L，混勻 10min， 4℃ 8000rpm離心 10min。 五、實驗步驟 ? RNA濃度測定 ? 取 1ul RNA樣品，加水 199ul后讀取260nm處的吸光度值 ? 260nm處的吸光度值相當于 40181。 ? 分子雜交 – 核酸分子雜交，其中又包括 Southern雜交及Northern雜交。 ? 將提取的植物總 RNA或 mRNA用變性凝膠電泳分離，不同的 RNA分子 將按分子量大小依次排布在凝膠上，將它們 原位轉(zhuǎn)移到固相膜 上，在適宜的離子強度及溫度下，探針與膜上同源序列雜交，形成 RNADNA雜交雙鏈 。生物素標記檢測是以 DIGdUTP為底物，用隨機摻入法進行 DNA標記， PCR合成標記有地高辛的探針，然后加入抗地高辛（ DIG） 堿性磷酸酶 復(fù)合物
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1