核酸分子雜交ppt課件(2)-在線瀏覽
2025-06-29 04:01本頁面
【正文】 ?掌握植物總 RNA提取的方法并熟練操作 ?用甲醛變性凝膠進(jìn)行電泳，檢測總 RNA提取質(zhì)量 ?對于不同的植物組織，選取不同的提取方法，提取植物的總 RNA 實(shí)驗(yàn)原理 ? 細(xì)胞破碎，核酸溶出 – 液氮速凍后，對植物組織進(jìn)行 研磨 可以破碎細(xì)胞。 – 細(xì)胞 提取液 可溶出核酸。 – 多糖、次生代謝物 ? 核酸的保護(hù)（ 內(nèi)源 RNA酶） – 低溫、苯酚、氯仿、 SDS可以部分抑制 RNA酶的活性，保護(hù) RNA不被酶解。L的 β巰基乙醇（終濃度 5%）。 3. 加入苯酚 /氯仿 /異戊醇（ 25:24:1）各 350181。 4. 取上清，加入等體積的氯仿 /異戊醇（ 24:1），搖床震蕩 10min，4℃ 8000rpm離心 10min。 20℃ 放置 20min后 4℃ ， 12022 rpm離心 10 min。 7. 棄上清，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥沉淀。L滅菌水中，備用。g/ml單鏈 RNA，以此來計(jì)算樣品含量。 實(shí)驗(yàn)步驟 ? RNA電泳 – RNA變性處理 ? 1ul RNA樣品加入 上樣緩沖液，混勻后 65℃ 溫育510min置于冰上冷卻（ 20ul RNA+50ul上樣緩沖液） – 檢測 RNA的凝膠要配制 ? MOPS ? 甲醛 – 電泳緩沖液為 1 M0PS 實(shí)驗(yàn)步驟 ? 用透明膠帶將膠板的兩端封好。 – 10 MOPS（ MOPS ， NaAC 50mM， EDTA 10mM， ） ? 待溶液冷卻至 60℃ 左右，加入10ml甲醛， 4ulEB替代品充分混勻。 注意事項(xiàng) ? 特別要注意的是在所有器具嚴(yán)格消毒，實(shí)驗(yàn)過程中需要帶手套，減少說話和走動等防止 RNase的污染，來保證RNA不被降解。 – 屬于蛋白質(zhì)分子“雜交”的 Western雜交。 ? 雜交的雙方是待測核酸及探針（ probe） – 待測核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因組 DNA或總 RNA – 被人為標(biāo)記上，該標(biāo)記可以通過某種特定方法檢出，即成為所謂的探針。 ? 要證明外源基因在植物染色體上整合的最可靠的方法是，只有經(jīng)分子雜交鑒定過的植物才可以稱為轉(zhuǎn)基因植物。 實(shí)驗(yàn)原理－分子雜交 ? Northern雜交是以 DNA或 RNA為 探針 ，檢測 RNA鏈，用于外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物特異 mRNA的檢測。 ? 利用探針中的 digoxigenin和 antidigoxigeninAp抗體結(jié)合，再通過堿性磷酸酶 AP與 CDPstar底物作用，檢測 CDPstar的化學(xué)發(fā)光間接進(jìn)行定量分析。 實(shí)驗(yàn)原理－ Northern雜交 實(shí)驗(yàn)原理－ RNA提取 ? 細(xì)胞破碎，核酸溶出 – 液氮速凍后，對植物組織進(jìn)行 研磨 可以破碎細(xì)胞。 ? 核酸的純化 – DNA的去除 – 酚、氯仿抽提使 蛋白質(zhì) 變性、沉淀，可去除蛋白。 ? 探針 – 探針序列需與感興趣的基因互補(bǔ) – 探針需要有熒光或同位素標(biāo)記以利于檢測 – 長度一般為 252022bp的 DNA或 RNA 實(shí)驗(yàn)原理－ 探針制備 gene X PCR probe U 堿性磷酸酶 OPO3 HPO4 O O 目標(biāo) mRNA Spacer Digoxigenin探針 AntiDigoxigenin Antibody Digoxigenin Hapten Alkali
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1