第十章核酸分子雜交技術(shù)-在線瀏覽
2024-11-10 15:27本頁面
【正文】 DNA分子結(jié)合不牢固 ②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈 DNA的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 ③化學(xué)活化膜：優(yōu)點： DNA與膜共價結(jié)合；對不同 大小的 DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低 Southern印跡的常用方法 （ 1）毛細管虹吸印跡法 利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的 DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 （ 3）真空轉(zhuǎn)移法 此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。根據(jù)檢測物分細胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分： DNA/DNA、 RNA/DNA、RNA/RNA 雜交 ? 保持組織細胞的形態(tài) ? 對核酸無抽提，修飾與降解作用 ? 不改變核酸在組織細胞內(nèi)的定位 ? 不阻礙核酸與探針的雜交過程 ? 對雜交信號無遮蔽作用 ? 理化性質(zhì)穩(wěn)定 雜交過程： （ 1）組織或細胞的固定 理想固定液應(yīng)具備： （ 2）組織細胞雜交前的預(yù)處理 ? 去垢劑（如 Triton x100和 SDS）和蛋白酶 K去除核酸表面的蛋白質(zhì) ? 組織細胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體 ? 控制消化時間，避免細胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻 片上脫落 （ 3）探針的選擇與標(biāo)記 ? 以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針 ? 探針的長度一般為 50~300bp ,有時達 ? 放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定 檢測結(jié)果分辨率高，但信號檢測時間長 ? 非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易 于觀察 （ 4）雜交 ? 雜交液體積?。?10~20μl ? cDNA和 RNA探針雜交溫度約為 50℃ ? 雜交時間 :DNA探針雜交為 2~ ? 雜交前一般將組織切片置 95 ℃ 5~15分鐘使 DNA變性 ? 沖洗溫度一般 不超過 50 ℃ （ 5）雜交結(jié)果檢測 ? 所用探針為核素標(biāo)記 ,放射自顯影檢測 ? 所用探針為非核素標(biāo)記 ,比色或化學(xué)發(fā)光檢測 五、液相雜交 指待測核酸和探針都存在于雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子的過程。 雜交過程 ? 制備待測 RNA ? RNA探針的制備與標(biāo)記：體外轉(zhuǎn)錄法制備和標(biāo) 記 RNA探針 ? 雜交：待測 RNA與 RNA探針在液相中雜交 ? RNaseA和 RNaseTI除去單鏈 RNA ? 電泳分離 RNA ? 放射自顯性檢測雜交結(jié)果 （二）核酸酶 S1保護分析法 原理 核酸酶 S1在一定條件下專一水解雜交體系中的單鏈 DNA和單鏈 RNA，不水解 DNA探針與待測RNA雜交形成的雜交體，使雜交分子得到保護，稱核酸酶 S1保護分析法 雜交過程 ? 制備待測 RNA：總 RNA或 mRNA均可 ? 單鏈 DNA探針的制備與標(biāo)記
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