【正文】 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式（1）計(jì)算： 式中： N樣品中菌落數(shù)； ∑C平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和； n1 第一個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)； n2第二個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)； d 稀釋因子（第一稀釋度）。 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colonyforming units,CFU）表示。3h. 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4ml），凝固后翻轉(zhuǎn)平板。水產(chǎn)品30℃177。1℃培養(yǎng)48h177。1℃恒溫水浴箱中）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。同時(shí)分別取1ml稀釋液加入兩個(gè)無菌平皿左空白對(duì)照。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無菌吸管或吸頭。用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用一支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。2h計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù) 計(jì)數(shù)菌落總數(shù)報(bào) 告 圖1 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序6 操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min~10 000r/min 均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1：10的樣品勻液。第一法 平板菌落計(jì)數(shù)法5 檢驗(yàn)程序 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1檢樣25g（或25 ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)~3個(gè)適宜樣品勻液，各取1ml分別加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15ml~20ml平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻 培 養(yǎng)36℃177。 1mol/L鹽酸（HCL）:移取濃鹽酸90ml用蒸餾水稀釋1000ml。4. 3 無菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min。4 培養(yǎng)基和試劑4. 1 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見第A..1章。 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm PH計(jì)或PH比色管或精密PH試紙。 無菌吸管：1ml（）、10 ml（）或微量移液器及吸頭。1℃. 天平：. 均質(zhì)器。1℃。3 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。 菌落總數(shù) 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1ml（或1g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果于半分鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者，為過氧化氧酶試驗(yàn)陽性；不發(fā)生氣泡者，為陰性。 (2)培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基(附錄Ⅱ—1．1),麥汁培養(yǎng)基. (3)試劑 3%過氧化氫溶液． (4)其它 酒精棉球，酒精燈，潔凈小試管，接種環(huán)等。有的菌具有過氧化氧酶，可將其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶．故過氧化氫酶試驗(yàn)是鑒別菌種的依據(jù)之一。2)學(xué)習(xí)過氧化氫酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。 (3)試劑 路哥氏碘液(附錄1—3．2)‘ (4)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色．三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱桿酶(Bacillussubtilis)。 (2)學(xué)習(xí)淀粉水解試驗(yàn)的操作技術(shù)。如系平板培養(yǎng)物，則可用試劑混合液滴到菌落上。 (2)試劑 同氧化酶試驗(yàn)。組成這類生物氧化體系的酶，主要是細(xì)胞色素類酵。四、方法與步驟以劃線接種法將試驗(yàn)菌接種于酪蛋白培養(yǎng)基上，然后置37℃恒溫箱培養(yǎng)1—2d后，觀察結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解試驗(yàn)陽性。三、實(shí)驗(yàn)材料（1）菌種 蠟樣牙孢桿菌和球形芽孢桿菌。實(shí)驗(yàn)六 酪蛋白分解試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解酪蛋白分解試驗(yàn)的用途及原理． (2)學(xué)習(xí)酪蛋白分解試驗(yàn)的操作技術(shù)． 二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌則不具有。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在葡萄糖銨斜面上有正常大小菌落生長(zhǎng)者為葡萄糖銨試驗(yàn)陽性，記“十”號(hào)；不生長(zhǎng)或只生長(zhǎng)為極微小的菌落，而在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好者，為陰性，否則記“一”。3） 接種 用無菌接種環(huán)分別取大腸桿菌菌液一環(huán)，在對(duì)應(yīng)的葡萄糖銨斜面培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。2） 制備菌懸液 將苗種相應(yīng)接人理鹽水管內(nèi)，研磨并攪動(dòng)使其均勻。三、實(shí)驗(yàn)材料1) 菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和福氏志賀菌（Shigelle flexneri）2) 培養(yǎng)基 葡萄糖銨培養(yǎng)基(附錄Ⅲ8),普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。二、原理 有的菌種能利用銨鹽作為氮源而生長(zhǎng)，有的菌則不能用，在葡萄糖銨培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)五 葡萄糖銨試驗(yàn)—、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解葡萄糖銨試驗(yàn)的用途及原理。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)基由綠色變成藍(lán)色者，表明實(shí)驗(yàn)菌能利用醋酸鹽作為碳源，故丙二酸鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性，記“十”號(hào)，培養(yǎng)基不變藍(lán)色者為陰性，否則記“一”。 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等．四、方法與步驟 取丙二酸鈉培養(yǎng)基試管三支，于其上分別做好培養(yǎng)基名稱和“大腸桿菌”及“沙門氏菌”及“空白對(duì)照”等標(biāo)記。二、原理 由于微生物的酶系統(tǒng)不同，故有的菌能利用醋酸鹽作為氮源，有的菌則不能，當(dāng)醋酸鹽被分解利用后，培養(yǎng)基中產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)基縣堿性，促使培養(yǎng)基中酸堿指示劑麝香草酚藍(lán)由綠色變成藍(lán)色，可利用此反應(yīng)來鑒別有關(guān)微生物。如兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次，如差別仍不明顯，則為陰性。適溫培養(yǎng)7D后觀察。試驗(yàn)時(shí)，往基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加糖類1％或醇、％—％，％。三，實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌()和枯草芽孢桿菌()。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體中撮搞培養(yǎng)或加入45℃左右的固體培養(yǎng)基中，用力振蕩后立即倒成平板。可用來測(cè)定的底物種類很多，有單糖類、雙糖類、糖醇類、脂肪酸類、羥基酸類、各種有機(jī)酸類、醇類、各種氮基酸類、胺類以及磺氫化合物等。二、原理 細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否含有代謝這種含碳化合物有關(guān)的酶，因而可作為鑒定的依據(jù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 試管中培養(yǎng)基顏色變黃者為該試驗(yàn)陽性，記“十”號(hào)，否則記“一”。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，愛得華氏菌（Edwardsiella sp） (2)培養(yǎng)基 ONPG培養(yǎng)基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。二、原理 在鄰硝基酚βD半乳糖苷培養(yǎng)基(ONPG培養(yǎng)基)中含有鄰硝基酚βD半乳糖苷和pH7．／L的磷酸緩沖液。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽性用“+”；陰性用“”表示。在培養(yǎng)基中加入乙醚l~2ml，經(jīng)充分震蕩使吲哚萃取至乙醚中．靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面。取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管3支，分別標(biāo)記大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。 (3)其它 二甲基氨基苯甲醛溶液，乙醚，酒精燈，接種針，恒溫箱等。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，枯草芽孢桿菌。能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基質(zhì))。 實(shí)驗(yàn)六 吲哚試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者胚嵩囼?yàn)(Ehrlich法)的原理和方法：學(xué)習(xí)吲哚試驗(yàn)(Ehrlich法)試驗(yàn)的操作技術(shù)。四、方法與步驟 ，各加入2~3滴甲基紅指示劑，注意沿管壁加入，仔細(xì)觀察培養(yǎng)液上層。培養(yǎng)液→指示劑→珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH ，使甲基紅指示劑變紅。實(shí)驗(yàn)五 甲基紅試驗(yàn)()一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤b別腸桿菌科各菌屬的甲基紅試驗(yàn)原理．學(xué)習(xí)甲基紅試驗(yàn)的操作技術(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陽性反應(yīng)(用“+”表示)；若不呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陰性反應(yīng)(用“”表示)。 (3)．觀察記錄a. 取出以上試管，振蕩2 min。(1)．標(biāo)記試管 取5支裝有葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管，分別標(biāo)記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。 (2)培養(yǎng)基 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的試管 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。革蘭氏染色過程：5. 實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1) 在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌？(2) 作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實(shí)驗(yàn)四 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)()一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤b別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法二、原理某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合、脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，(+)反應(yīng)。革蘭氏染色的關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時(shí)，陰性菌可被誤染為陽性菌。以分散開的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過于密集的細(xì)菌，常常呈假陽性。(6) 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察?！?4) 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。(2) 初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。3. 材料及器材(1) 大腸桿菌，枯草芽孢桿菌(2) 革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等4. 方法與步驟(1) 涂片將培養(yǎng)14—16小時(shí)的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24小時(shí)的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。脫色劑是將被染色的細(xì)胞進(jìn)行脫色，不同類型的細(xì)胞脫色反應(yīng)不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成的，在染色過程中，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，由于脫水而引起網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中的孔徑變小，通透性降低，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物被保留在細(xì)胞內(nèi)而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍(lán)紫色；革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質(zhì)含量高，當(dāng)用乙醇處理時(shí)，脂類物質(zhì)溶解，細(xì)胞壁的通透性增加，使結(jié)晶紫碘復(fù)合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復(fù)染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。革蘭氏染色法不僅能觀察到細(xì)菌的形態(tài)而且還可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的稱為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G+表示；染色反應(yīng)呈紅色（復(fù)染顏色）的稱為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G表示。2. 基本原理 革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類和鑒定的重要性狀。實(shí)驗(yàn)作業(yè)（選做3題）1．牛肉膏應(yīng)置于何種容器中稱量為宜?2．配制高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基時(shí)，可溶性淀粉需經(jīng)什么處理后才能倒入到沸水中? 3．何謂培養(yǎng)基的自然pH?4．培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的5．在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意些什么問題?為什么?6．配制合成培養(yǎng)基加入微量元素時(shí)最好用什么方法加入?天然培養(yǎng)基為什么不需要另加微量元素?7．有人認(rèn)為自然環(huán)境中微生物是生長(zhǎng)在不按比例的基質(zhì)中，為什么在配制培養(yǎng)基時(shí)要注意各種營(yíng)養(yǎng)成分的比例?8．你配制的高氏I號(hào)培養(yǎng)基有沉淀產(chǎn)生嗎?說明產(chǎn)生或未產(chǎn)生的原因。4．察氏培養(yǎng)基配制方法方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。然后用雙層紗布過濾，取濾液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加熱煮沸后加入瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水。(2) pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。7H2O可先配成高濃度的貯備液按比例換算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。(10) 無菌撿查將滅菌培養(yǎng)基放人37℃的溫室中培養(yǎng)24—48h，以檢查滅菌是否徹底。(8) 滅菌 ，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。加塞時(shí)的棉塞的總長(zhǎng)度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。因此棉塞質(zhì)量的好壞對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著很大的影響。 圖11 培養(yǎng)基的分裝 A 漏斗分裝裝置 ；B 自動(dòng)分裝裝置 1 鐵架 ；2 漏斗 ；3孔膠管 ；4彈簧夾 ；5玻璃 ；6流速調(diào)節(jié) ；7 裝量調(diào)節(jié) ；8開關(guān)分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。(5) 分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝人試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)。(4) 過濾 趁熱用濾紙或