基因工程制藥新版(2)(參考版)
2025-05-29 06:02本頁(yè)面
【正文】 （ 2）酵母 人工染色體的結(jié)構(gòu) （ 3）酵母人造染色體的使用 8： 其他載體 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動(dòng)物細(xì)胞載體 如腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 植物細(xì)胞載體 如農(nóng)桿菌載體。 C 2XB( 6. 6 kb )C O SC O SSm B HCEA m pr C O Sp J B8( 5. 4 kb )PE B ECHSm ACOS質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)圖 6：噬粒載體（ phagemid） 1. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ： 在質(zhì)粒載體中插入一段 M13或 fd的復(fù)制起點(diǎn)，其插入方向決定在噬菌體顆粒中形成正鏈還是負(fù)鏈 2. 優(yōu)點(diǎn) ⅰ .可以質(zhì)粒方式復(fù)制，高拷貝存在于 ，便于大量提取質(zhì)粒 DNA用于 DNA重組 ⅱ .當(dāng)有輔助噬菌體存在時(shí)（如 M13K07和 R408），噬質(zhì)粒重組 DNA分子將以 f1復(fù)制起點(diǎn)開始進(jìn)行復(fù)制，形成單鏈 DNA和噬菌體顆粒，形成的單鏈 DNA可用于定序和特異位點(diǎn)突變 T7AprF 1 o r ipGEM5Zf()( 3 0 0 3 b p )or il a c ZMC SSp 6T7AprF 1 or ipGEM5Zf()( 3 0 0 3 b p )or il a c ZMC SSp 6噬粒載體 pGEM結(jié)構(gòu) 7： 酵母 人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) （ 1）酵母人工染色體的必備元件 （ 2）酵母 人工染色體的結(jié)構(gòu) （ 3）酵母人造染色體的使用 （ 1）酵母人工染色體的必備元件 ?復(fù)制起始位點(diǎn) ?著絲粒：與有絲分裂時(shí)染色體在子細(xì)胞中的分配有關(guān)。 克隆超大基因，如鼠的三氫葉酸還原酶， 40kb以上。 （ 4）由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選 [C]、科斯質(zhì)粒的用途 常用的粘性粒有 PHC7 PJB MUA3和KOSI等，它們大多具有一種或多種限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)。 （ 3）進(jìn)入宿主細(xì)胞之后能夠進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。 [B]、科斯質(zhì)粒的特性 （ 1）分子量較小，由 4 kb6 kb組成，裝載量大（可達(dá) 45kb) 。 ? 因此， 插入柯斯質(zhì)粒的外源 DNA可大于 40kb。由于 pHC79有 pBR322DNA，所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性兩個(gè)標(biāo)記。 柯斯質(zhì)粒 pHC79系 ? 由質(zhì)粒 pBR322和 λ 噬菌體的 cos位點(diǎn)的一段 DNA構(gòu)成。 （ 3）含有質(zhì)粒的一個(gè)抗藥性標(biāo)記。 [A]、科斯質(zhì)粒的基本組成 [B]、科斯質(zhì)粒的特性 [C]、科斯質(zhì)粒的用途 Cos質(zhì)粒（考斯質(zhì)粒 Cosmid） [A]、科斯質(zhì)粒的基本組成 （ 1）含有 λ噬菌體 DNA的粘性末端序列（ COS序列）。 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） = cos序列 +質(zhì)粒。它的基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個(gè)間隔區(qū)可用來插入外源 DNA（ 基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之間 ）。 ⑤ M13噬菌體在用作載體時(shí)是 利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA： 單鏈 DNA的酶切和連接是比較困難的。 較大的間隔 位于基因 Ⅷ /Ⅲ 以及基因 Ⅱ /Ⅳ 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和 DNA合成的元件。 ? M13噬菌體的外型呈絲狀 ? M13 噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈 DNA組成 ? M13 DNA全長(zhǎng) 6407個(gè)核苷酸 ? M13 DNA上至少有 11個(gè)基因 2700個(gè)外殼蛋白分子 ? M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng) M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu) ? 單鏈 DNA，由 6407堿基組成。 M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu) ? M13噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。通過藍(lán)色噬斑的出現(xiàn)可以顯示噬菌體 M13的存在。復(fù)制型 M13可用作克隆載體。它是單鏈 DNA噬菌體中的一個(gè)典型的代表。 （ C） 增加選擇標(biāo)記 加裝選擇標(biāo)記 lacZ （ 5） λ 噬菌體載體的使用 重組 λ DNA的 構(gòu)建 (酶切，連接） λ 噬菌體的 體外包裝 λ 噬菌體 侵染 大腸桿菌 重組 λ DNA的 分離 （ 6） λ噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn) 容量大 ，裝載能力可達(dá) 23kb，便于構(gòu)建基因文庫(kù) 重組子篩選較為方便 DNA提取操作較為簡(jiǎn)便 4：?jiǎn)捂?DNA噬菌體 M13載體 M13噬菌體（ M13 phage）是一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體， 遺傳物質(zhì)是環(huán)狀單鏈 DNA,全長(zhǎng)約。 λ載體必要區(qū)是 28kb,理論上克隆能力為 23kb. （ B） 改造酶切位點(diǎn) 野生型的 λDNA鏈上有 5個(gè) EcoRI位點(diǎn)和 7個(gè) HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至 1 2個(gè)。 包裝限制： λphage頭部外殼蛋白容納 DNA能力上限 ≤105%，下限 ≥75%。 置換 型載體 置換型載體：可被外源 DNA置換的 λ噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對(duì)限制性酶切位點(diǎn)的載體，稱為置換型載體。 注意： λ噬菌載體作為載體，其重
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