基因工程制藥ppt課件(參考版)
2025-01-08 09:16本頁(yè)面
【正文】 ?末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶：催化一個(gè)單核苷酸轉(zhuǎn)移到一個(gè) DNA分子的 3’羥基末端。 ?核酸酶 S1：能降解單鏈 DNA和 RNA ，打開(kāi) cDNA雙鏈的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 工程菌（或細(xì)胞）構(gòu)建中重要的工具酶 ?大腸桿菌 DNA聚合酶 I： 5’— 3’DNA聚合酶活性。 ⒊費(fèi)用高。目前 DNA 合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為 50～ 60 bp，因此只適用于克隆小分子肽的基因。 ?原理： DNA是由 3’， 5’磷酸二酯鍵連接 ?技術(shù)： DNA自動(dòng)合成儀 用化學(xué)法合成目的基因 DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的 DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火使連接成較長(zhǎng)的 DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。 二、化學(xué)合成法 較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成。 分離到含有目的基因的陽(yáng)性克隆后，必須對(duì)其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定。 藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒與PCR鑒定重組質(zhì)粒 ⒎ 目的 cDNA克隆的分離和鑒定 核酸探針雜交法：用層析法純化微量蛋白，根據(jù)目的蛋白質(zhì)純品的氨基酸序列分析結(jié)果，人工合成相應(yīng)的寡核苷酸探針，從 cDNA文庫(kù)中分離特異 cDNA克隆。 ⒍ cDNA文庫(kù)的鑒定 根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌體顏色改變法。 ⒍ cDNA文庫(kù)的鑒定 基因文庫(kù)：匯集某一基因組所有 DNA序列的所有 DNA群體。 ⒋ cDNA的克隆 將 cDNA與載體連接（質(zhì)粒 DNA,噬菌體DNA ） 人工接頭 :人工合成的，連接在目的基因兩端的含有某些限制性酶切為點(diǎn)的寡核苷酸片斷
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