基因工程制藥新版ppt課件(參考版)
2025-01-11 04:33本頁(yè)面
【正文】 （ 4）由于用于基因表達(dá)的細(xì)胞均為 傳代細(xì)胞 ，而一般認(rèn)為傳代細(xì)胞都是惡化性細(xì)胞，因此，由它所生產(chǎn)出的基因表達(dá)產(chǎn)物有可能 存在致癌的疑問(wèn) 。 （ 2）單位體積的 生產(chǎn)率低 。 優(yōu)點(diǎn) （ 1）基因的表達(dá)產(chǎn)物可以迅速通過(guò) 細(xì)胞分泌 到培養(yǎng)液之中， （ 2）培養(yǎng)液成人完全能夠進(jìn)行 人工控制 ， （ 3）基因產(chǎn)物在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了 糖基化 ，更加接近于天然產(chǎn)物。 ? 1982， Palmiter將大鼠的生長(zhǎng)激素基因用微注射方法導(dǎo)入小鼠的受精卵中獲得 巨型小鼠（ supermouse） ， 從而在理論上和實(shí)踐意義上都將轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高一步 ， 引起生物學(xué)界極大的關(guān)注 ， 為基因工程育種提供誘人的前景 。 （ 4）菌株的 分泌能力 要強(qiáng)。 （ 2）菌體內(nèi)源蛋白酶要 弱 。 （ 6）宿主酵母菌株性能 宿主酵母的 生理狀況 等因素對(duì)外源基因的表達(dá)有明顯的影響。 （ 4）終止序列對(duì)表達(dá)效率也有影響 常用終止序列： ADH1 CYC1 Mfal PGK （ 5）外源蛋白質(zhì)的糖基化 應(yīng)用酵母菌生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的 糖基化 能夠增強(qiáng)所表達(dá)出蛋白質(zhì)的生理活性。 （ 2） 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 啟動(dòng)子基因有 PH0GALI、 GAL10，其基因表達(dá)受誘導(dǎo)物的影響 . （ 3）分泌信號(hào)的表達(dá)效率 分泌信號(hào) 的表達(dá)效率對(duì)于目的基因表達(dá)有影響。 酵母菌啟動(dòng)子類(lèi)型分 2類(lèi)： （ 1） 組成型啟動(dòng)子 它在酵母生長(zhǎng)的各時(shí)期都能發(fā)揮作用。 影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 （ 1）外源基因的拷貝數(shù)量 （ 2）啟動(dòng)子的類(lèi)型 （ 3）分泌信號(hào)的表達(dá)效率 （ 4）終止序列對(duì)表達(dá)效率也有影響 （ 5）外源蛋白質(zhì)的糖基化 （ 6）宿主酵母菌株性能 （ 1）外源基因的拷貝數(shù)量 外源基因的 拷貝數(shù)量 及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的 穩(wěn)定性 對(duì)于基因表達(dá)起決定作用 。 （ 2）精確表達(dá)載體 此類(lèi)載體要求外源基因有 特定的插入位點(diǎn) ，以便基因表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物相同。 （ 4）表達(dá)載體 表達(dá)載體 = 酵母菌啟動(dòng)子 + 載體 + 外源性目的 DNA + 酵母菌終止子 。 那些既能夠在 大腸桿菌中 進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇，又能夠在 酵母菌 中進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制和表型選擇的載體，稱(chēng)作 克隆載體 。 （ D） YIp稱(chēng)作酵母整合型質(zhì)粒，這類(lèi)載體有很好的穩(wěn)定性，但是拷貝數(shù)只有 1個(gè)。 （ B） YRp稱(chēng)作酵母復(fù)制型質(zhì)粒，這類(lèi)載體 穩(wěn)定性差 、 拷貝數(shù)量小 。 載體 影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 載體 （ 1）定義 （ 2）類(lèi)別 （ 3）克隆載體 （ 4）表達(dá)載體 （ 1）定義 酵母載體 是可以攜帶外源性目的基因進(jìn)入酵母細(xì)胞內(nèi)、并且能在酵母細(xì)胞內(nèi)保存、復(fù)制、隨著酵母細(xì)胞的分裂而傳遞到子代細(xì)胞的 DNA或者 RNA單位。 ④ mRNA的穩(wěn)定性，通常它的半衰期為幾秒 25min. ⑤ 密碼子偏愛(ài)性是影響翻譯效率的重要因素。 ② SD序列和真核基因起始密碼 ATG間的間距，會(huì)影響基因產(chǎn)物的表達(dá)。常見(jiàn)的啟動(dòng)子有 lac、 trp、 tac、bla等。 缺點(diǎn)： （ 1）產(chǎn)量不高， （ 2）信號(hào)肽不進(jìn)行切割或不能定點(diǎn)切割。 基因結(jié)構(gòu)為“原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核結(jié)構(gòu)基因片段 — 細(xì)菌信號(hào)肽基因 — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子”。 （ C2）融合基因 — 非融合蛋白 基因結(jié)構(gòu)為“ 原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 — 原核 ATG— TGATG（真核基因起始結(jié)構(gòu)） — 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子 ” 這一方式能夠 提高表達(dá)效率 。 [C]、非融合蛋白的具體表達(dá)方式 非融合蛋白表達(dá)方式可分為 2種 ： （ C1）非融合基因 — 非融合蛋白 （ C2）融合基因 — 非融合蛋白 （ C1）非融合基因 — 非融合蛋白 基因結(jié)構(gòu)為“ 原核啟動(dòng)子 — 原核 SD序列 —ATG— 真核結(jié)構(gòu)基因序列 — 原核終止密碼子 ” 要求 1： SD序列和 ATG之間的距離要合適，相差 23個(gè)堿基，其表達(dá)效率就大受影響。 [B]、優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 非融合蛋白能夠較好地保持真核蛋白質(zhì)的 生物活性。 （ D1） 融合表達(dá)載體的構(gòu)建 （ D2） 常用的融合蛋白（原核細(xì)菌表達(dá)蛋白質(zhì)） （ D3） 受體蛋白的 切除方法 ? 化學(xué)斷裂法： 溴化氰（ CNBr） Met（切點(diǎn)）AA ? 酶促斷裂法： 凝血因子 Xa，有蛋白酶活性，識(shí)別序列 :Ile－ Glu－ Gly－ Arg（切點(diǎn)） AA （ 2）非融合蛋白 [A]、定義 [B]、優(yōu)缺點(diǎn) [C]、具體表達(dá)方式 [A]、定義 非融合蛋白表達(dá) 方式是指工程菌大腸桿菌進(jìn)行蛋白質(zhì) 翻譯時(shí) ，是以 真核生物 的mRNA的 AUG為 翻譯起始點(diǎn) ，最后表達(dá)出的蛋白質(zhì)中 不含細(xì)菌蛋白 。 （ 2）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入 Met， CNBr可專(zhuān)一性識(shí)別 Met并 切開(kāi) ，形成原核多肽 +真核蛋白質(zhì)分子，從而獲得具有生物活性的天然真核蛋白質(zhì)分子。 [C]、改進(jìn)措施 （ 1）在細(xì)菌蛋白和目的蛋白間加入 IleGluGlyArg， 可被人體內(nèi)的 凝血因子 Xa識(shí)別而切開(kāi)。 [B]、優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)： （ 1）蛋白質(zhì)在細(xì)菌體內(nèi)比較 穩(wěn)定 ，不易被細(xì)菌的酶類(lèi)所降解， （ 2）容易實(shí)現(xiàn) 高效表達(dá)， （ 3）基因操作簡(jiǎn)便。 融合蛋白的 氨基酸 端由大腸桿菌 原核基因編碼 、而 羧基端 則由 真核基因編碼 。 MCS pET32 a(+)以 T7lac作為啟動(dòng)子； pET32 a(+) 還帶有 HisTag融合標(biāo)簽 ，此類(lèi)標(biāo)簽可用于檢
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