【正文】 所依據(jù)的 原理 是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈 DNA或 RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其 相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu) 。 有關(guān) Tm值 Tm值的計(jì)算： 1) 長(zhǎng)度為 25 mer以下的引物， Tm計(jì)算公式為： Tm = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T) 2) 對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸， Tm計(jì)算公式為： Tm = + x Log10[Na+] + (%GC) – 600/size 公式中， Size = 引物長(zhǎng)度 核酸分子雜交技術(shù)： 具一定同源性的 兩條 (DNA或RNA)單鏈 在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按 堿基互補(bǔ)配對(duì) 原則特異性地復(fù)性， 形成雙鏈 。 ?Tm值與溶劑性質(zhì)有關(guān)。 ?不同序列的 DNA， Tm值不同。 ?Tm值 : 就是 DNA熔解溫度，指把 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時(shí)的溫度。 ? 堿基對(duì)： 核酸分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤與胞密啶總是通過(guò) 氫鍵相連 形成固定的堿基配對(duì)關(guān)系，因此稱為 堿基對(duì)， 也稱為堿基互補(bǔ)。 ? 核苷酸： 核苷分子中戊糖的 羥基 與 一分子磷酸 以 磷酯鍵 相連而成的化合物稱為核苷酸。超螺旋 DNA在 TAE中的電泳分辨率要好于 TBE。 三個(gè)作用： 1）增加樣品密度保證 DNA沉入加樣孔內(nèi)； 2）使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程； 3）指示劑（染料）在電場(chǎng)中的遷移可以為預(yù)測(cè)樣品的遷移位置作參考。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)，應(yīng)叫 交替電場(chǎng)凝膠電泳 。反之，較小的 DNA 移動(dòng)較快，于是不同大小的分子被成功分離。 為何選 PFGE？ B+ A +A B 脈沖電場(chǎng)電泳示意圖 這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的。 聚丙烯酰胺凝膠濃度（ %） 分離 DNA片斷大?。?bp） 100—1000 25—500 1—50 瓊脂糖凝膠電泳： 100—50000 bp 聚丙烯酰胺凝膠電泳： 1—1000 bp 四、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 (pulsedfield gel electrophoresis，PFGE ) 超過(guò)一定大小的雙鏈 DNA分子在瓊脂糖凝膠中幾乎以相同速率遷移 , 大于該極限長(zhǎng)度（ 50 kb）后 DNA的遷移速率幾乎與分子大小無(wú)關(guān)，即使用 %的瓊脂糖凝膠也不能對(duì)其分離 , 但工作需要常要進(jìn)行 分離大分子 DNA如分離大腸桿菌染色體 DNA。 1%的稀溶液與皮膚接觸也會(huì)引起皮膚發(fā)炎，小鼠的確切致死量（ LD50）為 170mg/㎏ ，所以在實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)應(yīng)盡量避免與之直接接觸和吸入粉塵。 凝膠的 EB染色的注意事項(xiàng) 凝膠介質(zhì) : 聚丙烯酰胺主要由 丙烯酰胺 和 N， N′ 甲叉雙丙烯酰胺 聚合而成 . 注意 : 丙烯酰胺為白色結(jié)晶粉末，無(wú)味，分子量為 ，為中樞神經(jīng)毒物。 染色原理 用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn) DNA對(duì) DNA片斷大小的估算 ?EB被認(rèn)為是一種強(qiáng)致癌物質(zhì) ?EB可用來(lái)檢測(cè)單鏈或雙鏈核酸 ?EB使用時(shí)的配制、貯存及使用 EB常用水配制成 10 mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為 μg/ml 。 EB在 300nm紫外光照射下能 發(fā)橙紅色熒光 ，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置。 SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣品中，價(jià)格較昂貴。 ? 可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA分子。 具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的 DNA片段泳動(dòng)速度不一樣 ，可進(jìn)行分離。 ? 核酸為兩性分子，在 pH ，整個(gè)分子帶正電 ,pH 8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。 3. 瓊脂糖凝膠的分辨力 濃度大小決定其分辨分子大小的能力。 瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。 二 、瓊脂糖凝膠電泳 1. 瓊脂糖 2. 瓊脂糖凝膠 瓊脂糖在水里（或電泳液）中加熱到沸點(diǎn) (或90 ℃ )后溶解，冷卻 (45 ℃ 后又凝固成均勻的的膠體。 5. 因此，電泳可以： ① 分離不同分子質(zhì)量的 DNA； ② 分離相同分子質(zhì)量但構(gòu)型不同的 DNA ,以及帶電荷多寡的 DNA； ③ 制備純化特定 DNA片段。摩擦系數(shù)主要與 分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度 有關(guān)。 2. 電泳遷移率同 電場(chǎng)的強(qiáng)度 和分子本身所帶的 凈電荷數(shù)目 成正比。 1）若 RNA樣品 OD260/OD280比值太小，說(shuō)明有蛋白質(zhì)或酚的污染； 2）比值大于 ，可能被異硫氰酸胍等污染； 3） OD260/OD230比值小于 ，表明有小分子及鹽存在。 注：可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含 RNA的 DNA溶液比值為。 1) OD260/OD280大于 ，表明有 RNA污染。 DNA的 純度 可用 OD260與 OD280的比值來(lái)衡量。 ? 當(dāng) OD260/ OD280小于 。 ? DNA 的 OD260/OD280值 大約為 。 核酸的保存 核酸含量 /純度的測(cè)定 紫外分光光度法 原理： 根據(jù)核酸分子中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在 λ=260nm處有最大吸收值，可采用紫外分光光度法測(cè)定核酸的含量。 ② 長(zhǎng)期保存可以沉淀形式貯于乙醇中 。 DNA ： ① DNA樣品溶于 pH TE， 4 ℃ 或 20 ℃ 保存； ② 長(zhǎng)期保存樣品中可加入 1滴氯仿。低溫長(zhǎng)時(shí)間沉淀，易導(dǎo)致鹽與 DNA共沉淀，影響以后的實(shí)驗(yàn)。 缺點(diǎn)：易使鹽類、蔗糖與 DNA共沉淀．異丙醇難以揮發(fā)除去（最后用 70％乙醇漂洗數(shù)次）。 缺點(diǎn)：需要量大。 如何使用酚 沉淀是濃縮核酸最常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)如下： ①改變核酸的溶解緩沖液； ②重新調(diào)整核酸的濃度； ③去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。 變色的酚不能用于核酸抽提實(shí)驗(yàn) ，因?yàn)檠趸锟善茐暮怂岬牧姿岫ユI。 ?電泳檢測(cè) RNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析 A) RNA降解 ? 外源 RNase的污染 ? 裂解液質(zhì)量 ? 裂解液用量不足 ? 樣品本身富含 RNase ? 環(huán)境溫度過(guò)高 28S 18S 5S B) DNA殘留 ? 樣本量過(guò)多 ? 吸取到中間層及下層試劑 解決辦法： DNA酶（ RNase free）消化，再抽提純化處理。 核酸長(zhǎng)度與結(jié)合 EB的數(shù)量成正比，所以28S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度一般比 18S rRNA條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng) 。 制備 RNA的關(guān)鍵 —防止內(nèi)外源 RNase的作用 原理： ，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放； B. 釋放出來(lái)的 DNA和 RNA由于低 pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的有機(jī)相（ DNA）和水相（ RNA），從而得以分離； ，沉淀，得到純凈 RNA。 2) 解決辦法： 外源 RNase：高溫，焦磷酸二乙酯 (DEPC)處理幾乎所有溶液和器皿，操作者帶手套。 1) RNase的特點(diǎn)： 抗酸、抗堿 ,具很廣 pH作用范圍 。 RNA提取的基本原理與方法 ? RNase是導(dǎo)致 RNA降解的最主要物質(zhì)！ ? RNase的來(lái)源 ? 樣品 ? 試劑 ? 多次使用的器具 ? 裸露的手 ? 說(shuō)話產(chǎn)生的唾沫 ? 空氣 RNase非常穩(wěn)定，它在一些極端的條件可以暫時(shí)失活，但限制因素去除后有迅速?gòu)?fù)性。如較早的質(zhì)粒 pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過(guò)氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。 質(zhì)粒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析 A) RNA殘留 ? 忘記加 RNase A？ ? I液中 RNase A失效？ ? 酶量不夠？ B) 質(zhì)粒斷裂 ? II 液裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)？ ? 裂解時(shí)動(dòng)作過(guò)于劇烈 ？ 質(zhì)粒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析 C) 量少 ? 凝膠是否有問(wèn)題？ ? 菌體量少 ? 菌體重懸不徹底 ? 裂解不完全 ? 菌株老化 ? 嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒 質(zhì)粒 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析 ? 嚴(yán)謹(jǐn)型： 這些質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制之下進(jìn)行的，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。 12022r/min離心 5 min，去上清，Eppendorf管倒扣于吸水紙上，吸干液體。 變性 質(zhì)粒提取 ——堿裂解法原理 質(zhì)粒提取的思路 ? 質(zhì)粒的特性 ：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量 DNA ? 要去除的物質(zhì) ：蛋白 /基因組 DNA/脂類 /小分子雜質(zhì) /RNA 三個(gè)基本步驟： 細(xì)菌的生長(zhǎng)和質(zhì)粒的擴(kuò)增 菌體的收集裂解及質(zhì)粒 DNA的分離 質(zhì)粒 DNA的純化 Solution I ： 50 mM 葡萄糖， 25 mM TrisHCl()， 10 mM EDTA， （ RNase A） M NaOH， % SDS 3 M 醋酸鉀 /2 M 醋酸（ pH ) Solution II ： Solution III ： 三種溶液的配方 注：現(xiàn)配現(xiàn)用 質(zhì)粒提取的步驟 ① 取 ml培養(yǎng)物倒入 Eppendorf管中， 12022 r/min， 4 ℃ ，30 sec，吸去培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥； ② 將細(xì)菌沉淀懸浮于 100μl預(yù)冷的 溶液 I中，劇烈振蕩； ③ 加 200μL溶液 II（新鮮配制），蓋緊 Eppendorf管，快速顛倒 5次，混勻內(nèi)容物，冰置 35 min。 ，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體 DNA、 RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒 DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA。 ? 常常編碼一些對(duì)宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等 ? 質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（ 1n個(gè)） 松弛型復(fù)制（ 20個(gè)以上） 堿裂解法提取質(zhì)粒的原理 pH ~ ，大分子量染色體 DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。 （ 6）保存 DNA 4 ℃ /20 ℃ /80 ℃ 細(xì)菌基因組 DNA的提取 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組 DNA的提取 基因組 DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題分析 A) DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng) ? DNA中含有蛋白、多糖、多酚類物質(zhì) ——抽提純化、高鹽洗滌 ? DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) ——重新沉淀或進(jìn)一步晾干 ? DNA中殘留有金屬離子 ——重新 70%乙醇漂洗 B) DNA降解 ? 材料不新鮮或反復(fù)凍融 ? 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 ? 提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈， DNA被機(jī)械打斷 ? 外源核酸酶污染 C) DNA提取量少 ? 實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 —— 選取新鮮（幼嫩）材料 ? 破壁或裂解不充分 ——充分研磨、破壁酶、延長(zhǎng)裂解時(shí)間 ? 沉淀不完全 ——低溫、延長(zhǎng)沉淀時(shí)間 ? 洗滌使得丟失 DNA ——小心操作，保留上清液 重點(diǎn)介紹經(jīng)典的提取方法： 堿裂解法（三液法）。 離心 （ 10,000 rpm, 10 min) 收集 DNA沉淀，室溫晾干。 （ 4）沉淀 DNA 加入 DNA（選擇性加 1/10體積的3 M醋酸鈉）。離心（ 10,000 rpm, 10 min)去沉淀，上清入新管。 CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細(xì)胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 乙醇沉淀 DNA溶液 操作步驟 : （ 1）組織粉碎 取少量樣品（ g)，吸干水分，加液氮冷凍后迅速研磨成細(xì)粉末。 CTAB提取緩沖液（ 2 ）的經(jīng)典配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM M 2%(W/V) %（ V/V） 使用前加入 TrisHCl （ ）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase活性； NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使 DNA充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； β巰基乙醇 是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除。 基本步驟： CTAB法提取植物 DNA的原理 (植物 DNA提取經(jīng)典方法） A. CTAB（ hexadecyl