基因工程制藥(參考版)
2025-01-07 13:33本頁面
【正文】 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。 DNA同源序列之間的特異性互補雜交是該技術(shù)的基本理論依據(jù) 外源蛋白質(zhì)檢測 利用插入 DNA所表達的蛋白質(zhì)的 功能 或者 結(jié)構(gòu) 性質(zhì)，檢測外源蛋白質(zhì)的存在。 缺點：假陽性高。 抽提少量重組 DNA→PCR 擴增 → 電泳鑒定 →序列分析。是基因克隆最常用的檢測方法。（ 空載體 ） ? 如果在 LacZ基因區(qū)段插入外源性目的基因，就會造成 LacZ基因的失活，結(jié)果就不生成藍色菌落。 載體： 編碼 β 半乳糖 宿主： 編碼 β 半乳糖 苷酶 N端 序列 苷酶 C端 序列 α 互補 細菌表達： β 半乳糖苷酶活性 ↑ 5溴 4氯 3吲哚 （ Xgal） → 形成 藍色菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中 插入外源 DNA→β 半乳糖苷酶的 N端基因失活 → 不能與宿主 β半乳糖苷酶的 C端 進行 α 互補 → 產(chǎn)生 白色菌落 。當(dāng)培養(yǎng)基中有 IPTG時，使含此質(zhì)粒的菌在 Xgal培養(yǎng)基上形成 藍色菌落 。轉(zhuǎn)化細胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。 實驗參數(shù)條件方面： 實驗操作對轉(zhuǎn)化率影響較大，特別是電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化電壓，電容，電阻等參數(shù)的設(shè)置非常重要。 載體的空間構(gòu)象： 質(zhì)粒的 超螺旋 構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，其轉(zhuǎn)化率要比新制備的質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。一微克 pUC18共有 1011個分子（ 1017 / 2686 660），即每 3400個 pUC18分子才有一個分子進入受體細胞 在實際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細胞，大約含有 2 1010個大腸桿菌細胞，也就是說， 每 200個細胞只有一個細胞能接納 pUC18 DNA 。 （ 3）大腸桿菌的 ?噬菌體轉(zhuǎn)染 酵母的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法 （ 1）乙酸鋰轉(zhuǎn)化法 （ 2）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 （ 3）電轉(zhuǎn)化法 （二）轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化率 單位質(zhì)量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生 轉(zhuǎn)化子 的數(shù)量。在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或 DNA重組分子便可進入細胞內(nèi)。此時細胞經(jīng)過熱脈沖發(fā)生收縮作用，細胞膜出現(xiàn)間隙，此時質(zhì)粒 DNA可通過進入細胞。 PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)過酶切直接與T載體連接， T/A克隆 ? 隨后就可以利用質(zhì)粒上插入基因兩側(cè)的酶切位點來克隆基因。 （三）提高重組率的方法 加大外源基因片段與載體的比例 選擇基因序列固有的酶切位點 在利用 PCR擴增基因的同時引入酶切位點 利用中間載體提供酶切位點 加大外源基因片段與載體的比例 （ 1）外源基因片段與載體的比例為 5:110:1 （ 2） 5’ 末端去磷酸化 選擇基因序列兩側(cè)固有酶切位點 選用酶切位點 ,不能在基因序列內(nèi)部 雙酶切產(chǎn)生粘端連接 單酶切 粘端連接 平端連接 在利用 PCR擴增基因的同時引入酶切位點 利用 PCR擴增基因時，在引物序列中加入特定的限制性酶切位點 序列，在擴增基因的兩側(cè)就帶有了該特定酶切位點。 （三）具體方法： 同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端連接 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接 不同限制性內(nèi)切酶粘性末端的連接 人工粘性末端的連接 5’突出末端 人工粘性末端的連接 3’突出末端 粘性末端的添加與更換，利用人工接頭 Linker 幾種主要的連接策略 同種限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端連接 同尾酶產(chǎn)生的粘性末端連接 不同限制性內(nèi)切酶粘性末端的連接 人工粘性末端的連接 5’突出末端 人工粘性末端的連接 3’突出末端 粘性末端的添加與更換，利用人工接頭 Linker 二、接（體外重組） （一）重組率 含有外源 DNA的重組分子數(shù) /載體分子總數(shù) （二）重組特性： 粘性末端的重組率 大大高于 平末端。 ? 2023年 4月 14日 公布人類基因組基本信息。 ? 八十年代中期 PCR技術(shù)發(fā)明 ? 1985年 第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊）培育成功。 ? 1978年 Genentech公司生產(chǎn)出世界上第一種基因工程蛋白藥物 人胰島素。 目前，我國已經(jīng)批準(zhǔn)了 12種基因工程藥物和疫苗上市。 五、基因工程制藥所使用的生物技術(shù) （ 1） DNA重組技術(shù) （ 2）淋巴細胞雜交瘤技術(shù) （ 3）細胞培養(yǎng)技術(shù) （ 4）克隆表達技術(shù) 六、我國基因工程制藥的進展 α 1b型基因工程干擾素 ，是我國自行研究開發(fā)的具有國際先進水平的基因工程藥物，于 1997年通過 III期臨床，并獲得國家 一類新藥證書 。 （ 3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)掘
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