基因工程制藥新版(2)(已修改)
2025-06-07 06:02 本頁面
【正文】 第三節(jié) 基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程 一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源 DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源 DNA與載體 DNA的切割與連接 五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮? 六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長代謝的特點(diǎn) 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn) 九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù) 十、變性蛋白的復(fù)性 十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制 十二、基因工程藥物的制造實(shí)例 血紅蛋白基因 血紅蛋白基因排列順序 血紅蛋白的結(jié)構(gòu) 血紅蛋白的運(yùn)送氧氣功能 血紅蛋白的基因工程流程 一、工具酶的分離純化 （一）基因工程制藥所用到的工具酶 （二）關(guān)于限制酶 （三）關(guān)于連接酶 （一）基因工程制藥所用到的工具酶 限制性內(nèi)切酶 甲基化酶 Klenow聚合酶 T4DNA聚合酶 T4多核苷酸激酶 堿性磷酸酶 核酸酶 S1 核酸酶 Bal31 綠豆核酸酶 核糖核酸酶 人外切核酸酶 DNA酶 1 外切 RNA酶 III 外切 RNA酶 VI DNA聚合酶 1 T4DNA連接酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 T4RNA連接酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 大腸桿菌 DNA連接酶 （二）關(guān)于限制酶 宿主限制現(xiàn)象 限制酶的定義 限制酶的特征 限制酶的作用 基因工程所用到的限制酶 影響限制酶作用的因素 宿主限制現(xiàn)象 病毒或噬菌體在 宿主 A細(xì)胞中生長良好 ,但在 宿主 B細(xì)胞中生長很差 ,原因是它的 DNA受到宿主 B的限制 ,這種現(xiàn)象是 宿主控制性限制 （ restriction）與修飾 (modification) ,簡(jiǎn)稱（ R/M體系）。 ? 細(xì)菌的 R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的 DNA與外來的 DNA，并能使后者降解掉。 ? R/M體系： 是由兩種酶活性配合完成的： ? 一種是修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶 ? 另一種是核酸內(nèi)切限制酶 EcoB核酸酶和 EcoB甲基化酶 ※ 當(dāng) λ(k)噬菌體侵染 ，由于其 DNA中有EcoB核酸酶特異識(shí)別的堿基序列，被降解掉。而 DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在 EcoB甲基化酶的作用下，催化 S腺苷甲硫氨酸（ SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識(shí)別序列的特定堿基，使之甲基化。 ※ EcoB(大腸桿菌 B株 )的核酸酶不能識(shí)別已甲基化 的序列。 ? R/M體系的作用： ? 保護(hù)自身的 DNA不受限制； ? 破壞外源 DNA使之迅速降解 TGAN8TGCT ACTN8ACGA TGAN8TGCT ACTN8ACGA ECOB核酸酶 甲基化酶 CH3 CH3 CH3 CH3 噬菌體來源序列 宿主來源序列 ※ 限制性內(nèi)切酶本是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。 ※ 由于 R/M現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)使得核酸內(nèi)切酶成為基因工程重要的工具酶。 限制酶的定義 凡是能夠 識(shí)別和切割 DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶稱為限制酶。限制酶分為三個(gè)類型： （ 1） Ⅰ 型限制酶 由于其切點(diǎn)不固定，很難形成特異性的切割末端。 （ 2） Ⅱ 型限制酶 是位點(diǎn)特異性酶，是基因工程理想 的工具酶。 （ 3） Ⅲ 型限制酶 對(duì) DNA的識(shí)別與切割點(diǎn)不同，不產(chǎn)生特異性 DNA片段。 限制酶的特征 具有專一性的識(shí)別位點(diǎn)。 能夠形成固定的核苷酸單鏈末端。 比較適合于進(jìn)行DNA結(jié)構(gòu)的分析和進(jìn)行基因重組。 限制酶的作用 （ 1）進(jìn)行 DNA重組。 （ 2）構(gòu)建新載體。 （ 3）構(gòu)建基因文庫。 （ 4）進(jìn)行 DNA序列分析。 （ 5）制備 DNA放射性探針。 基因工程所用到的限制酶 通常是 Ⅱ 型限制酶 ，具體有以下幾種。 EcoRI HindIII BamHI PstI SstI SalI AvaI BclI HindII HpaI BglII ClaI HaeIII HhaI HinfI HpaII MboI SmaI XbaI XhoI 影響限制酶作用的因素 （ 1） DNA的純度 （ 2） DNA的甲基化程度 （ 3） DNA的結(jié)構(gòu) （ 4）反應(yīng)的溫度 最適溫度為 37度 （ 5）反應(yīng)的緩沖體系 反應(yīng)體系中通常含有MgCl NaCl、 KCl、 β 巰基乙醇、二硫蘇糖醇、牛血清白蛋白。它們具有激活酶、穩(wěn)定酶的作用。 （三）關(guān)于連接酶 定義 凡是能夠催化 DNA片段 5’末端的磷酰基 與 3’末端的羥基 結(jié)合成 磷酸二酯鍵 的酶，稱為連接酶。 作用 主要用于 （ 1）正常 DNA的合成。 （ 2）損傷 DNA的修復(fù)。 種類 （ 1
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