【正文】 生命科學(xué)學(xué)院 第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ) 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶 (如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶， DNA聚合酶等 )作為工具對基因進(jìn)行人工切割，拼接和擴(kuò)增等操作。所以把這些酶稱之為 “ 工具酶 ” 。 生命科學(xué)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 第二章 基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ) 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 第二節(jié) DNA連接酶 第三節(jié) DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 第四節(jié) DNA修飾酶 第五節(jié) 外切核酸酶 第六節(jié) 單鏈內(nèi)切核酸酶 第七節(jié) RNA酶 生命科學(xué)學(xué)院 本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容 ? 限制性核酸內(nèi)切酶、同裂酶、同尾酶、星星活性。 ? II型限制性核酸內(nèi)切酶命名原則、操作注意事項(xiàng)及產(chǎn)生星活性的原因、影響酶活性的因素。 ? DNA聚合酶的種類及性質(zhì) ? 其它常用工具酶的功能及其用途。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 任何一種生物體都存在防御外界物質(zhì)進(jìn)入的機(jī)制 限制 /修飾系統(tǒng) (RM, Restrictionmodification system) 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 大腸桿菌 B 大腸桿菌 K 修飾的 phage λ (B) EOP=104（限制作用） EOP=104（限制作用） EOP=1（修飾作用） 修飾的 phage λ (K) 人們發(fā)現(xiàn)侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的 限制與修飾現(xiàn)象 簡稱（ R/M體系 ）。 細(xì)菌的 R/M體系類似于免疫系統(tǒng)，能辨別自身的 DNA與外來的 DNA，并能使后者降解掉。 一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象 EOP Efficiency of plate 成斑率 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象 限制 (restriction)：指一定類型的細(xì)菌可以通過限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體 DNA，導(dǎo)致噬菌體的寄主幅度受到限制。 限制作用 :實(shí)際就是限制性內(nèi)切酶降解外源 DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象 修飾 (modification)：指寄主本身的 DNA，由于在合成后通過 甲基化酶 的作用得以甲基化，使 DNA得以修飾 ， 從而免遭自身限制性酶的破壞。 修飾作用 :宿主細(xì)胞通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象 1968 Linn和 Arber從 B中發(fā)現(xiàn)限制酶 Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血桿菌發(fā)現(xiàn)限制酶 Ⅱ 1978 W. Arber， H. ， Nathans因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻(xiàn)獲得諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 一、寄主的限制與修飾現(xiàn)象 寄主控制的限制與修飾的作用 一是保護(hù)自身的 DNA不受限制； 二是破壞外源 DNA使之迅速降解。 基因工程中，應(yīng)采用缺少限制作用的菌株作為受體 。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 二、限制性內(nèi)切酶的類型 限制性核酸內(nèi)切酶（限制性酶） ：在細(xì)胞內(nèi)能夠識(shí)別雙鏈 DNA分子中的特定核苷酸序列，并對 DNA分子進(jìn)行切割的一種酶。 據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ 、 Ⅳ 型。 主要特性 Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型 限制修飾 蛋白結(jié)構(gòu) 輔助因子 識(shí)別序列 切割位點(diǎn) 雙功能（具甲基化） 異源三聚體 ATP Mg2+ SAM 距識(shí)別序列 1kb處 隨機(jī)性切割 單一功能 同源二聚體 Mg2+ 46bp回文序列 識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割 雙功能（具甲基化） 異源二聚體 ATP Mg2+ 距識(shí)別序列下游 2426bp處 隨機(jī)性切割 基因工程中使用 注： SAM為 S－腺苷甲硫氨酸 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 1. I型限制性內(nèi)切酶 首先由 M. Meselson和 R. Yuan在 1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的。 如 EcoB和 EcoK。 （ 1）識(shí)別位點(diǎn)序列 未甲基化修飾的特異序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK： AAC(N)6GTGC 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 （ 2）切割位點(diǎn) 在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約 1000— 1500 bp處隨機(jī)切開一條單鏈。 （ 3）作用機(jī)理 需 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 Recognize site cut 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 2. II類限制性內(nèi)切酶 首先由 . Smith和 . Wilcox在 1970年從流感嗜血菌中分離出來。 分離的第一個(gè)酶是 Hind Ⅱ （ 1）識(shí)別位點(diǎn)序列 未甲基化修飾的雙鏈 DNA上的特殊靶序列（多數(shù)是回文序列），與 DNA的來源無關(guān)。 A B C C’ B’ A’ A’ B’ C’ C B A A’ B’ N’ B A A B N B’ A’ 或 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 （ 2）切割位點(diǎn) 識(shí)別位點(diǎn)處。 切開雙鏈 DNA。形成粘性末端（ sticky end）或平齊末端（ blunt end）。如： EcoR I 5’G?AATTC3’ 3’CTTAA?G5’ Pst I 5’CTGCA?G3’ 3’G?ACGTC5’ 產(chǎn)生粘性末端 EcoR V 5’GAT?ATC3’ 3’CTA?TAG5’ 產(chǎn)生平齊末端 生命科學(xué)學(xué)院 A A G C T T T T C G A A A A G C T T T T C G A A A B C D DNA DNA HindⅢ HindⅢ 切割位點(diǎn) 核酸內(nèi)切酶 HindⅢ 對雙鏈 DNA分子的切割作用 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 3. III類限制性內(nèi)切酶 在完全肯定的位點(diǎn)切割 DNA(識(shí)別位點(diǎn)下游 2426bp)，但反應(yīng)需要 ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 主要特性 Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型 限制修飾 蛋白結(jié)構(gòu) 輔助因子 識(shí)別序列 切割位點(diǎn) 多功能（具甲基化） 異源三聚體 ATP Mg2+ SAM 距識(shí)別序列 1kb處 隨機(jī)性切割 單一功能 同源二聚體 Mg2+ 46bp回文序列 識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割 雙功能（具甲基化） 異源二聚體 ATP Mg2+ 距識(shí)別序列下游 2426bp處 隨機(jī)性切割 核酸限制性內(nèi)切酶的類型及主要特性 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 三、限制性內(nèi)切酶的命名 1973年 Smith和 D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下： 3個(gè)字母的略語表示寄主菌的物種名。 大腸桿菌（ Escherichia coli）用 Eco表示； 流感嗜血菌（ Haemophilus influenzae）用 Hin表示。 2. 用一個(gè)右下標(biāo)的大寫字母表示 菌株或型 。如 EcoK, EcoR（現(xiàn)在都寫成平行，如 EcoRI）。 3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復(fù)系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如 EcoR I， EcoR V。 4. 限制酶前面要帶上 R（ Restriction)， 修飾酶前面要帶上 M（ Modification） (現(xiàn)已省略 )。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切