第二章基因工程制藥新版7(參考版)
2024-11-19 22:12本頁面
【正文】 24.11.172024年11月17日星期日9時(shí)24分26秒24.11.17,謝謝大家！,。24.11.1724.11.1709:2409:24:2609:24:26Nov24 相信命運(yùn)，讓自己成長，慢慢的長大。2024年11月17日星期日9時(shí)24分26秒09:24:2617 November 2024 科學(xué)，你是國力的靈魂；同時(shí)又是社會(huì)發(fā)展的標(biāo)志。2024年11月17日星期日上午9時(shí)24分26秒09:24:2624.11.17 讓自己更加強(qiáng)大，更加專業(yè)，這才能讓自己更好。24.11.1724.11.1709:24:2609:24:26November 17, 2024 加強(qiáng)自身建設(shè)，增強(qiáng)個(gè)人的休養(yǎng)。24.11.1709:24:2609:24Nov2417Nov24 日復(fù)一日的努力只為成就美好的明天。24.11.1724.11.17Sunday, November 17, 2024 人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。,分泌型重組人胰島素表達(dá)法,上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌β半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng) , 但不能分泌 , 只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。,一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略是將胰島素或胰島素原編碼序列與β 內(nèi)酰胺酶基因拼接 , β 內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。,生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià),目前美國Ely LiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。,A鏈和B鏈分別表達(dá)法,生產(chǎn)技術(shù)評(píng)價(jià),為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本 , 美國Ely LiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線。 1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。 （2）取體重1820g小鼠5只，每只尾靜脈注射人體臨床允許最大量的3倍劑量，飼養(yǎng)7天，如果小鼠全部存活，說明成品合格。 干擾素效價(jià)測定:采用細(xì)胞病變抑制法，用Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測系統(tǒng)。 無菌試驗(yàn):微生物學(xué)檢測法。,（2）成品檢定7項(xiàng)指標(biāo),物理性狀:外觀為微黃色疏松體，加注射用蒸餾水后，不得含有肉眼可見的不溶物。 1無菌試驗(yàn):微生物學(xué)檢測法。 肽圖測定:用CNBr裂解法測定，每一批次間應(yīng)保持一致。 紫外光譜掃描:用全自動(dòng)掃描紫外分光光度計(jì)測定光譜圖，其最大吸收值應(yīng)為280nm177。g）的鼠IgG含量應(yīng)在100ng以下。 殘余外源性DNA含量測定:用放射性核素或生物素探針法測定，每劑量中的殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù) 純度測定 （1）銀染顯色法測定應(yīng)為單一顯色區(qū)帶， （2）掃描儀測定純度應(yīng)在95%以上， （3）SDSPAGE電泳測定允許少量聚合體存在，但不超過10%， （4）高效液相色譜測定應(yīng)呈一個(gè)吸收峰，主峰應(yīng)占峰總面積的95%， （5）GPC柱純度測定也應(yīng)呈一個(gè)吸收峰狀態(tài)，主峰應(yīng)占峰總面積的95%。,質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求,（1）半成品檢定 （2）成品檢定,（1）半成品檢定13項(xiàng)指標(biāo),干擾素效價(jià)測定:用細(xì)胞病變抑制法，用Wish細(xì)胞、VSV病毒作為基本檢測系統(tǒng)。再經(jīng)DE52柱進(jìn)行純化 ↓ 收集含有收集人干擾素a2b部分。15000r/min離心30min，除去不溶物。 ↓ 4000r/min離心30min，除去上清液。 ↓ 用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L ↓ 攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50% 30℃發(fā)酵8小時(shí)（細(xì)菌增殖階段） 42℃誘導(dǎo)23小時(shí)（產(chǎn)物生產(chǎn)階段） ↓ [監(jiān)控手段：每隔不同時(shí)間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。 ↓ 進(jìn)行高效表達(dá)提取分離純化成品,（2）流程圖,[A]、上游工藝流程 [B]、下游工藝流程,[A]上游工藝流程,誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸 ↓ 通過寡dT纖維素柱提取mRNA pBR322質(zhì)粒 ↓ ↓ 5%23%蔗糖密度梯度離心提取12S mRNA 內(nèi)切酶切割 ↓ ↓ 由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA 切割段位于β內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi) ↓ 結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素 雙鏈cDNA用末端PstI酶切割 ↓ 再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或者dG 在pBR322質(zhì)粒DNA的切割段加上dA或者dC ++++++++++++++++ 退火獲得雜交質(zhì)粒 ↓ 轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12 ↓ 篩選能抗四環(huán)素、但對(duì)氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株 ↓
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