【正文】 24.11.172024年11月17日星期日9時(shí)22分45秒24.11.17,謝謝大家！,。24.11.1724.11.1709:2209:22:4509:22:45Nov24 相信命運(yùn)，讓自己成長(zhǎng)，慢慢的長(zhǎng)大。2024年11月17日星期日9時(shí)22分45秒09:22:4517 November 2024 科學(xué)，你是國(guó)力的靈魂；同時(shí)又是社會(huì)發(fā)展的標(biāo)志。2024年11月17日星期日上午9時(shí)22分45秒09:22:4524.11.17 讓自己更加強(qiáng)大，更加專(zhuān)業(yè)，這才能讓自己更好。24.11.1724.11.1709:22:4509:22:45November 17, 2024 加強(qiáng)自身建設(shè)，增強(qiáng)個(gè)人的休養(yǎng)。24.11.1709:22:4509:22Nov2417Nov24 日復(fù)一日的努力只為成就美好的明天。24.11.1724.11.17Sunday, November 17, 2024 人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。端磷酸基 D. 使核酸片段的5180。端加上磷酸基 B. 去除核酸片段的3180?！?180?！?180?！?180?！?180?！?180?！?180?！?180?！?180?！?180。→3180。只有粘接法的1%。 缺點(diǎn)：（1）存在DNA片段的自身環(huán)化現(xiàn)象、和DNA線(xiàn)性化現(xiàn)象。C,重組體,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)： （1）本方法是DNA重組中最簡(jiǎn)單的一種方法。,（六）、平接法,定義 優(yōu)缺點(diǎn),定義,具有3羥基、和5磷?；钠烬R末端的DNA之間，在T4DNA連接酶的作用下，通過(guò)形成共價(jià)鍵結(jié)合，稱(chēng)為平接法。,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)適用于所有外源性DNA片段的定向克隆 缺點(diǎn)： （1）載體會(huì)產(chǎn)生自身線(xiàn)性聚合。 linker用化學(xué)方法合成的、具有某些限制酶專(zhuān)一識(shí)別位點(diǎn)的、由812個(gè)脫氧核苷酸殘基組成的單鏈。,Eco RⅠ,定義,在目的基因兩端分別接上不同的 linker，然后將其與載體同時(shí)用二種不同的限制酶進(jìn)行切割，再將切割產(chǎn)物進(jìn)行連接的方法。,（五）、雙接頭法,定義 優(yōu)缺點(diǎn),人工接頭及其應(yīng)用,CCGAATTCG GGCTTAAGC,5180。 （4）方法簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣。 （2）具有任何末端的載體、外源性DNA均可以通過(guò)此法進(jìn)行重組。 （4）用DNA聚合酶I補(bǔ)足裂口處缺失的核苷酸。 （2）在小牛胸腺末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，在載體兩端3OH上引入2030個(gè)dG（或者引入50150個(gè)dA）、在目的基因兩端3OH上引入2030個(gè)dC（或者引入50150個(gè)dT）。 5180。 3180。 5180。 3180。 5180。 3180。 缺點(diǎn)無(wú)法避免目的基因的自身環(huán)化+目的基因的線(xiàn)性聚合現(xiàn)象。 優(yōu)點(diǎn)： （1）載體脫磷克隆法避免了載體DNA的自身環(huán)化現(xiàn)象， （2）也降低了載體DNA的線(xiàn)性聚合現(xiàn)象。 （2）反應(yīng)過(guò)程中仍然會(huì)產(chǎn)生自身線(xiàn)性聚合體。,(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接,連接方式,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)在連接過(guò)程中，只要外源性目的基因、載體之間粘性末端不互補(bǔ)，就不會(huì)產(chǎn)生自身環(huán)化現(xiàn)象。 （3）方法將外源DNA、pBR322同時(shí)用HihdIII、BamHI進(jìn)行切割，那末，外源性目的基因、pBR322載體就會(huì)同時(shí)產(chǎn)生出HihdIII粘性末端、BamHI粘性末端。,（二）、定向克隆法,定義與方法 連接方式 優(yōu)缺點(diǎn),定義與方法,（1）定義利用特異性的單一切點(diǎn)的限制酶，將目的基因按正確方向插入到載體DNA的方法，稱(chēng)為定向克隆法。,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)比較簡(jiǎn)單，容易操作。,例子,插入失活藍(lán)白斑篩選技術(shù),根據(jù)插入失活原理，篩選重組子。,（一）、插入滅活法,定義與方法 例子 優(yōu)缺點(diǎn),定義與方法,定義將外源性基因插入到載體的選擇性基因區(qū)域（標(biāo)記區(qū)域）、并使這一選擇性標(biāo)記區(qū)域失活的連接法，稱(chēng)為插入滅活法。 平接法具有3羥基、和5磷?；钠烬R末端的DNA之間，在T4DNA連接酶的作用下，通過(guò)形成共價(jià)鍵結(jié)合，稱(chēng)為平結(jié)法。 粘接法具有互補(bǔ)粘性末端的目的基因，與載體DNA，在DNA連接酶的作用下，通過(guò)形成共價(jià)鍵結(jié)合，稱(chēng)為粘結(jié)法。,構(gòu)建cDNA文庫(kù),依據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽EST，設(shè)計(jì)引物用PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組中特異片段。,差異展示PCR法（DDPCR),原理：將具有兩組細(xì)胞在某一條件下可表達(dá)的mRNA 群體通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄方法變成相應(yīng)的cDNA 群體，以此為模板，利用一對(duì)特殊引物，在一定條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與mRNA相對(duì)應(yīng)的DNA。,差異顯示技術(shù),利用mRNA差異顯示技術(shù)、減數(shù)PCR技術(shù)、差減雜交技術(shù)尋找新基因。 鳥(niǎo)槍法的難點(diǎn)必須有一種有效的目的基因檢測(cè)方法，常用mRNA作為探針，進(jìn)行原位雜交法檢驗(yàn)。 ↓ 采用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，從眾多的菌落中選出帶有目的基因的菌株。 ↓ 將每一片段和載體進(jìn)行重組。,表達(dá)序列的磁珠捕捉法是具有代表性，利用磁場(chǎng)力對(duì)cDNA文庫(kù)中目的基因進(jìn)行富集的一種方法。除掉未結(jié)合的非特異性cDNA。,cDNA文庫(kù)插入片斷也用載體引物行PCR，然后與