【正文】 孔號(hào)血清稀釋度材料 生理鹽水血清 (1： 10)病毒 (4U)％雞血球 1 血清對(duì)照 11— 2 21： 10— 112 31： 202020 41： 401 12 51： 801 12 61： 1。 孔號(hào)病毒稀釋度 (1)生理鹽水 (2)病毒 1 螺旋圈 (3)％雞血球 11： 58 2 21： 102 2 31： 202 2 41： 402 2 51： 802 2 61： 1602 2 71： 3202 2 81： 6402 2 91： 12802 2 101： 25602 2 11 棄去 12 對(duì)照 2 2 2. 室溫靜置 30— 40 分鐘后肉眼觀察結(jié)果，必要時(shí)可用放大鏡觀察，計(jì)算結(jié)果與試管法同以 ++為終點(diǎn)。每孔加 %雞血球 2 滴。 二 .血凝抑制試驗(yàn) 依下表加入各種品 (單位： ml) 孔號(hào)血清稀釋度抗血清鹽水抗原混勻后作用 10 分鐘 ％雞紅細(xì)胞懸液各 毫升稍加振蕩置室溫 60 分鐘結(jié)果 11/ 21/ 31/ 41/ 51/ 61/ 71/ 81/ 9 血清對(duì)照 鹽水 10 血球?qū)φ?— — 最高稀釋孔仍呈完 全抑制凝集，該血清稀釋度即為血凝抑制效價(jià)。 凝集效價(jià)：能使血球呈 ++凝集的病毒最高稀釋度為凝集效價(jià)，即含一個(gè)血凝單位，實(shí)用時(shí)應(yīng)用 毫升病毒懸液中含 4 個(gè)血凝單位。 +約有 25%血球凝集，血球于孔底形成一個(gè)小團(tuán)，四周有小凝集塊。 +++基 本同上，大約 75%血球凝集，但邊緣不整有下垂趨向者。陰性者，血球孔底形成一個(gè)小團(tuán)，光滑圓潤，邊緣整齊者。 一．血球凝集 依下表加入各樣品 (單位： ml) 孔號(hào)生理鹽水病毒液病毒稀釋度 ％雞紅細(xì)胞搖勻后室溫或 4℃經(jīng)30～ 60 分鐘結(jié)果 結(jié)果判定：觀察結(jié)果，切勿將板振搖，應(yīng)輕輕拿起，觀察孔底。而在血球與病毒混合前加入病毒的特異性抗體，則血球凝集現(xiàn)象不出現(xiàn)，此稱血球凝集有抑制現(xiàn)象，借此可以鑒定病毒或測定體內(nèi)的抗體。已知能與流感病毒發(fā)生血凝現(xiàn)象的動(dòng)物紅細(xì)胞至少有 22 種。常用的方法有血凝抑制、補(bǔ)體結(jié)合等。 最后，按下列公式計(jì)算出每毫升待測血清的總補(bǔ)體活性，以單位/毫升表示之。由于 50%溶血 (y=)的 y/(1─ y)值等于 1。然后計(jì)算各測定管的溶血率 (ｙ值 ) 再計(jì)算各 管的ｙ／ (１－ｙ )值。再減去按待測血清每管實(shí)際用量計(jì)算出的血清色度ＯＤ值 (８０／８００ⅹ該管實(shí)際量ⅹ第８管ＯＤ值 )。 ) ?從水浴中取出后，立即將各管以2020轉(zhuǎn)／分離心１０分鐘，將各管上清液分別移于另一試管。 ３．補(bǔ)體 CH50 單位測定 ? 按下表加樣： 試管號(hào) 需加試劑 (ml)123456 (溶血對(duì)照 )7 (血球?qū)φ?)8 (血清對(duì)照 ) 1： 800 血清樣品 ——— 1： 80 血清樣品 ——————— 致敏綿羊紅細(xì)胞 — 稀釋液 — 蒸餾水 —— ——— —— ? 將各管充分混合。充分混合。 為配制的 50%細(xì)胞懸液體積，為于一定量 5%細(xì)胞懸液中應(yīng)加入稀釋的 ml 數(shù)：為已知標(biāo)準(zhǔn)化的１ 100 個(gè)細(xì)胞／ ml 懸液的 540 值─。 取 50%細(xì)胞懸液 1ml，加于 14ml 蒸餾水中測值為。加入 100%硫酸鎂溶液 1ml，可增強(qiáng)補(bǔ)體的效能。 材料及器材 1．稀釋液 (磷酸鹽緩沖生理鹽水 ) NaCl 17g Na2HPO4 11g KH2PO4 蒸餾水 100ml 使用時(shí)取此原液 50ml，加 90ml 蒸餾水。所以用 50%溶血作為終點(diǎn)要比100%溶血更為敏感。在 50%溶血周圍，線段近似一條直線。 圖 11 小白鼠腹腔注射法示意圖 實(shí)驗(yàn)二 50%溶血試驗(yàn) (CH50)測定補(bǔ)體 50%溶血試驗(yàn)即求得能使 50%致敏羊紅細(xì)胞發(fā)生溶血的最小量血清，然后計(jì)算出每毫升血清中補(bǔ)體含量。然后將小白鼠用染料作好標(biāo)記。左手傾斜使小鼠頭部向下，然后將注射器針頭自小白鼠左側(cè)腹股溝部刺入皮下，使針頭在皮下組織內(nèi)前進(jìn)約 1 厘米左右，再直立注射器，輕輕向下刺入腹腔內(nèi) (這樣可防止拔針后注入的材料外溢 )。 2. 固定小白鼠：用右手輕拖鼠尾，使其趴在金屬網(wǎng) 蓋上，再突然用左手拇指和食指抓緊小白鼠頸部及兩耳，將鼠體收入手掌中，再用左手無名指和手掌夾住小白鼠尾根，以無名指和小指夾住其左腿。一個(gè)巨噬細(xì)胞可吞噬數(shù)個(gè)雞紅細(xì)胞，吞噬后經(jīng)消化的雞紅細(xì)胞輪廓不清。 4．同法于 1 小時(shí)、 2 小時(shí)后再作一次腹腔液涂片染色鏡檢。 2． 48～ 72 小時(shí)之后在腹腔注入 25%洗滌過的雞紅血球懸液 1ml。 (二 )巨噬細(xì)胞吞噬紅血球的作用 (示教 ) 材料： 1．動(dòng)物 小白鼠 2． 25%雞紅血球懸液， 1%可溶性淀粉，無菌注射器及針頭。 4．鏡檢時(shí)尋找白血球，觀察細(xì)胞染液中有無吞噬的細(xì)菌。 3．注射后用毛細(xì)吸管輕輕刺入小白鼠腹腔吸取腹腔液。將無菌肉湯 2— 3 毫升注射入小白鼠腹腔內(nèi)引起大量白血球聚集于小白鼠腹腔內(nèi)。 觀察結(jié)果： 第 1 管 澄清透明， 第 2 管仍渾濁 一． 吞噬作用 (一 )白血球的噬菌作用 材料： 1．動(dòng)物 —— 小白鼠 2．菌種 —— 甲型鏈球菌菌液 3．無菌注射器及針頭，玻璃毛細(xì)管，美蘭染液，玻片，無菌肉湯，滅菌小棉花包。 3． 取 2 支小試管，加菌液 ，向第一管加唾液 ml，向第二管加唾液 ml 作為對(duì)照。 材料： 1． 細(xì)菌培養(yǎng)物 2． %無菌生理鹽水 3． 小試管 2 支；平皿 1 個(gè)； 1 ml 移液管 3 支 方法： 1．試驗(yàn)前一天，將細(xì)菌移種普通斜面 37℃培養(yǎng) 24 小時(shí)，用生理鹽水洗下菌苔稀釋至適當(dāng)濃度 (722 型分光光度計(jì)上波長 450 納米 光密度 )。溶菌酶對(duì)于革蘭氏陽性菌的作用在于裂解細(xì)胞壁中的乙酰胞壁酸和乙酰葡糖胺之間的連接，可導(dǎo) 致細(xì)菌死亡。分析經(jīng)血清與生理鹽水作用后細(xì)菌死亡情況及其與時(shí)間的關(guān)系。 2． 將平板放 37℃溫箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)。于30 分及 60 分后，再取出 1 號(hào)試管各采一接種環(huán)菌液分別劃線接種于培養(yǎng)基相應(yīng)部分。 待血清與菌液作用 10 分鐘后，取出 1 號(hào)試管加以加以振蕩，使細(xì)菌均勻懸于液體中，然后采一接種菌液劃線接種于培養(yǎng)基 1039。 6039。 1． 取普通瓊脂平板一塊，用蠟筆在底上劃分為四等分，分別標(biāo)記為 1039。加菌液時(shí)，防止菌液接觸管壁以免污染管壁，造成結(jié)果的錯(cuò)誤。 3．用另一支吸管吸取無菌生理鹽水 毫升，加入第二管內(nèi)。 一．正常血清的殺菌作用 材料： 1．血清：新鮮無菌免疫血清 2．菌種：傷寒培養(yǎng)液 3．無菌小試管無菌吸管：瓊脂平板 37℃水浴箱無菌生理鹽水方法 方法： 1．取無菌小試管 2 支，分別注明 2 號(hào)。乙型溶菌素及備解素系統(tǒng)等，可殺死革蘭氏陰性或陽性細(xì)菌。皮膚具有機(jī)械的阻擋作用，黏膜可分泌許多液體，如淚液、唾液、胃液、腸液等，其中喊含有溶菌酶，可溶解和殺死細(xì)菌。 機(jī)體的天然免疫機(jī)構(gòu)對(duì)消滅侵入的微生物具有重要的作用。 基本原理： 機(jī)體的天然免疫機(jī)制是通過機(jī)體在種族進(jìn)行過程中由于不斷與病原微生物進(jìn)行斗爭而建立起來的。 3000 轉(zhuǎn) /分離心 30 分鐘，取上清夜即為粗脂多糖抗原，置冰箱中保存?zhèn)溆谩? (三 )煮沸法 方法： 將培養(yǎng) 后得到的濃菌液沸水浴煮沸 2 小時(shí)。 3. 處理液經(jīng) 3000 轉(zhuǎn) /分，離心 30 分鐘，吸取上清液即為脂多糖抗原。 (二 )超聲波處理法 方法： 1. 獲得的菌液經(jīng) 2500 轉(zhuǎn) /分， 20 分鐘離心洗滌 1— 2 次，將沉淀配成 2 倍于濕菌濃度的濃菌液。 7. 透析后的水溶液層經(jīng)濃縮 (如用聚乙二醇在透析袋外層涂抹以除去水分 )。 2. 將沉淀的菌混勻于蒸餾水中，放 66℃水浴，然后滴加等量的 90%熱酚溶液 (預(yù)熱至 66℃ )，邊加邊搖，而后在 66℃水浴中攪拌 25 分鐘 3. 在水浴中冷卻，于 4℃冰箱過夜 4. 以 2020 轉(zhuǎn) /分離心 15 分鐘 5. 將上層水溶液吸到另一試管中 6. 剩下的酚層及殘?jiān)M分可再加上述同量水在熱水浴中攪拌 30 分鐘，冷卻，離心，取上層水溶液。經(jīng)離心后沉淀含細(xì)胞殘?bào)w。 (一 )熱酚提取法 原理是將細(xì)菌懸液加于熱酸 —— 水混合液中，冷卻，離心混合液可分為水溶液層，內(nèi)含水溶性脂多糖及核酸等及酸層、內(nèi)含蛋白質(zhì)。 3．免疫動(dòng)物 可采用 一次性免疫法，即將抗原與佐劑制成的乳劑分多個(gè)點(diǎn)兔背部皮膚，也可注入足底 2— 4 針各 毫升，總量約 3 毫升，一個(gè)月后試血。 方法： 1．弗氏佐劑的制備 將羊毛脂與石蠟油按 1： 5 比例混合，高壓滅菌。 三．抗人血清抗體的制備 材料： 1．動(dòng)物：家兔 2．人血清 3．羊毛脂、石蠟油、卡介苗。如需 10%血球懸液時(shí)，則吸取 1 毫升洗滌后的紅血球加生理鹽水9 毫升即成。洗滌 4 次則血球變脆不適于使用。如此連續(xù)洗 3 次，最后一次可離心沉淀 10 分鐘以使血球密集管底。 二 .抗紅細(xì)胞抗體 (溶血素 )的制備 材料： 1． 動(dòng)物： 家兔 2． 紅細(xì)胞懸液 3． 其它：無菌生理鹽水，保存液 (阿氏液 )等 方法： 2. 紅細(xì)胞懸液的制備 (1) 采血 采取的綿羊血與滅菌的保存液等量混合，置冰箱中，可保存數(shù)周，也可用抗凝方法 (2) 洗滌血球 先將抗凝血液離心沉淀 (2020cpmⅹ 5 分鐘 )吸去上清。試血合格可頸動(dòng)脈放血 (方法見附錄 )。用上述菌液作試管凝集試驗(yàn)，滴定抗菌血清中抗體的效價(jià)，效價(jià)在 1： 2020以上可放血。 (2) 將已稀釋的抗原按以下劑量及程序注入兔耳靜脈。與進(jìn)行免疫用的細(xì)菌做凝集試驗(yàn)，測定有無天然凝集素。 (4) 菌液的稀釋可按下列公式計(jì)算： =所需加鹽水的毫升數(shù) (原液毫升數(shù)原液每毫升含菌數(shù) ) 欲得稀釋液濃度 — 原液毫升 如原液 5 毫升，每毫升含菌 45 億今欲稀釋為每毫升含菌 10 億的溶液應(yīng)加生理鹽水的毫升數(shù)： (5 45)/(105)= 毫升 即細(xì)菌原液 5 毫升加生理鹽水 毫升稀釋即成。與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相比較，視其濁度相當(dāng)于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當(dāng)菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可得到每毫升中所含細(xì)菌的數(shù)量。 菌液濃度的計(jì)算及稀釋法： 菌液的濃度可用麥克法倫特氏標(biāo)準(zhǔn)比濁法來測定，方法如下： (1) 分別配制 1%硫酸溶液及 1%氯化鋇溶液 (2) 取口徑相等質(zhì)地相同的試管 10 支，依下表所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號(hào)碼備用。 Ⅱ .應(yīng)用液的制備： 合格的原液用標(biāo)準(zhǔn)比濁管計(jì)算含菌落數(shù)目后，用生理鹽水稀釋至每毫升含菌 10 億。經(jīng)檢查無菌時(shí)可以使用 (如無傷寒桿菌 O 菌株也可用 H 菌株制備 O 抗原。用作無菌試驗(yàn)即將菌液接種于肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng) 4 天，無活菌生長者才可使用。用無菌甲醛生理鹽水洗下菌苔，將洗下液體裝入無菌試管內(nèi)，置 37℃恒溫箱 18— 24 小時(shí)以殺菌。 2. 菌液的制備 Ⅰ .原液制備： H 菌液的制備：將合格的傷寒桿菌 H 菌株接種于普 通瓊脂的克氏瓶或大試管內(nèi) 37℃孵育 18— 24 小時(shí)。 方法： 1. 抗原的制備： 標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇：所用的菌種傷寒桿菌 H901 和傷寒桿菌 O901 應(yīng)具有典型形態(tài)菌落及生化反應(yīng)。因此在制備免疫血清時(shí)要根據(jù)抗原的不同選擇適宜的動(dòng)物種類和免疫方法。免疫血清不但對(duì)傳染病的診斷、預(yù)防和治療有重要意義，而且對(duì)器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義。經(jīng)過一定時(shí)間后，動(dòng)物血清中可以產(chǎn)生大量的特異性抗體。 全脾臟中抗體產(chǎn)生細(xì)胞總數(shù)可依下述公式計(jì)算： 實(shí)驗(yàn)八 抗原和免疫血清的制備 (設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) ) 抗體是機(jī)體接受抗原刺激后產(chǎn)生的一種具 有免疫特異性的球蛋白。 7．將作好的標(biāo)本水平置濕盒中，放 37℃溫箱中孵 60 分鐘 8．溶血空斑計(jì)數(shù) 肉眼觀察空斑并計(jì)數(shù)兩個(gè)小室出現(xiàn)的溶血空斑數(shù)。 5．混合細(xì)胞的灌注 用 100ul 的微量加樣器吸取被檢細(xì)胞混合懸液，于小 室開口一端輕輕將液體注滿小室 (勿使氣泡產(chǎn)生，勿使液體外溢 )，記錄實(shí)際注入的細(xì)胞懸液微升數(shù) (約 70ul) 每個(gè)樣品注 2 個(gè)