免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(參考版)
2025-08-08 02:22本頁(yè)面
【正文】 。它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－ DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片斷的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。 ELISA與 western blot比較 ? western blotting 可以看到特異性的條帶，但是定量比較麻煩 ? ELISA可以直接讀出濃度，但是如果抗體有非特異性結(jié)合，那得到的數(shù)值就不可信； ? WB只能半定量 ,但是可以檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白 ,這點(diǎn) ELISA做不到； ? WB所檢測(cè)的一般是抗原，而 ELISA抗原抗體都可以檢測(cè)； ? WB所檢測(cè)的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚體、降解產(chǎn)物等，一句話(huà)， WB可以確定所用抗體是與那種蛋白起作用的；而 ELISA無(wú)能為力； ? WB一次處理量就是一塊膠版， 1020個(gè)樣品最多了。 ELISA多用于定量分析，其靈敏度非常高。 ? ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)） 用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測(cè)的樣品多是血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液，因而沒(méi)有用到組織包埋、切片等技術(shù)，這是與免疫組化的主要區(qū)別，操作上 開(kāi)始需要將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，從而使后來(lái)形成的抗原 抗體 酶 底物復(fù)合物粘附在載體上，這就是“吸附”的含義。 結(jié)果判斷 ? 設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照 :陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 ? 陽(yáng)性細(xì)胞顯色分布 :胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型 免疫學(xué)三大工具比較 ? 免疫熒光 是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)熒光激發(fā)，來(lái)對(duì)組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究 (主要是定位 )。 分類(lèi) 實(shí)驗(yàn)方法 ? 將培養(yǎng)好的貼壁細(xì)胞用 PBS輕輕漂洗 2次 (PBS提前置室溫 )，避免細(xì)胞脫落； ? 4%多聚甲醛室溫固定 30min (靜置 )； ? PBS涮洗 3次，然后搖床緩慢搖洗 5min 3次； ? % Triton100室溫緩慢搖 30min，涮洗 3次； ? 用與二抗同源的血清（ 10%），室溫緩慢搖晃封閉 1h ，置濕盒內(nèi)； ? 用燒杯裝 PBS，涮洗玻片一次； ? 用紙將 PBS吸干后，滴加一抗（約 100 ul）， 4度過(guò)夜，置濕盒中。 3T3 Line PtK1 Line NBL6 Line RK13 Line Longitudinal Fissure Blood Vessels Cerebellum 定位 直接法：熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。 ? 原理： 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。 內(nèi)參名稱(chēng) 分子量大小 適用范圍 Tubulin 55kD 胞漿和全細(xì)胞 VCDA1/Porin 31kD 線(xiàn)粒體 COXIV 16kD 線(xiàn)粒體 Lamin B1 66kD 細(xì)胞核 TBP 38kD 細(xì)胞核 八、非特異條帶多 答： 1 抗體特異性不夠，考慮使用單抗，保證抗體的特異性； 2 蛋白降解，應(yīng)盡量使用新鮮制備的樣品，提取后一定要分裝，避免反復(fù)凍融。 八、做 western必須要內(nèi)參嗎？ 答：內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義 ,表明的確是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化 .所以?xún)?nèi)參是必須做的。 七、檢測(cè)到的抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 答：抗原形成了二聚體。 六、用于 western的抗體和用于 ELISA的抗體有什么不同的要求？ 答：一般來(lái)說(shuō)用于 western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性； 而用于 ELISA的抗體則要看抗原種類(lèi)，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。 3 抗體效價(jià)低，可以減少抗體的稀釋倍數(shù)，增加抗體濃度。 結(jié)果分析 二、目的帶很弱 答： 1 標(biāo)本中靶蛋白含量低，可以加大樣品的上樣量。 ? 應(yīng)用化學(xué)發(fā)光，膜可以再生檢測(cè)其他蛋白。 固相免疫檢測(cè) ? DAB顯色原理： DAB在 HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物 ，從而指示目的蛋白位置及強(qiáng)弱。 ? ，防止破裂 注意事項(xiàng)： ? 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用 ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光）發(fā)光或DAB（ 3,3二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測(cè)目的蛋白。 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度 ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 丙烯酰胺濃度 (%) 線(xiàn)性分離范圍／ KDa 15 1043 12 1260 10 2080 3694 57212 ? ???并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱(chēng)量或配膠時(shí)應(yīng)戴手套及口罩 ? ，應(yīng)隔周新鮮配制 ? TEMED，應(yīng)立即混勻并快速灌注入玻璃夾槽中 ? ，在無(wú)樣品孔中也應(yīng)加入適量的 4 蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液 ? （負(fù)極在上，正極在下）以保證蛋白由上向下方向電泳 ? 4℃ 冰箱中進(jìn)行 注意事項(xiàng)： 轉(zhuǎn)膜 ? 凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，常用的固相支持物有 NC （硝酸纖維素）膜、尼龍膜及 PVDF（聚偏氟乙烯）膜。 ? 當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時(shí)，它會(huì)以其碳鏈與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來(lái) ,而以磺酸根離子外露與水分子作用。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)含量太高則會(huì)使帶形扭曲 ,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪? 基于以上兩方面原因，在進(jìn)行蛋白電泳之前，先要對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行含量測(cè)定 蛋白定量 ? 目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮尿法（ Biuret法）、Folin－酚試劑法（ Lowry法）、紫外吸收法以及 考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford法）。 ? Western Blot作為一項(xiàng)半定量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，電泳前，必須盡量使各組 之間總蛋白量基本一致 。 ，所有操作應(yīng)在冰上完成。一旦眼睛或皮膚接觸了 PMSF，立即用大量水沖洗。 B． RIPA buffer： TrisHCl 50 mM, pH NP40 1% 去氧膽酸鈉 % NaCl
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