【正文】 有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作。（3）酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定，然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度），在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。吸附溫度、時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24h。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。本實驗底物為TMB，最大吸收波長為450nm，因此，應測定OD450值?！窘Y(jié)果分析】1．肉眼判定 明顯顯色者判為陽性，否則判為陰性。（3）在反應孔中加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體），37℃孵育30～60imn，洗滌，最后一遍用洗滌液或蒸餾水洗滌。（2）加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體），置37℃孵育1h，洗滌。2．用于檢測未知抗體的間接法：圖5－2 間接法原理示意圖 （1）用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1mg/L～1０mg／Ｌ，4℃過夜。依據(jù)所呈顏色的深淺，以“＋”、“－”號表示。（5）終止反應：。37℃～1h，洗滌。同時做空白孔、陰性對照孔、陽性對照孔。（2）加樣：，置37℃孵育1h。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min?！痉椒ú襟E】1．用于檢測未知抗原的雙體夾心法：圖5－1 雙體夾心法原理示意圖 （1）包被：用pH 、（包被緩沖液）將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1mg/L～10mg/L。（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。試劑（1）包被緩沖液（、）； （2）洗滌緩沖液（ PBS）；（3）稀釋液【％牛血清白蛋白（BSA）或使用以羊血清、兔血清等與洗滌液配成的5%—10%液】； （4）終止液（2 M H2SO4）； （5）底物緩沖液（pH ）；（6）TBM（四甲基聯(lián)苯胺）使用液；（7）ABTS顯色液；【注：ABTS,2,2’Azinobis(3ethylbenztbiozoline6sulfonic acid),即2，2’連氮基雙（3乙基苯并噻吡咯啉6磺酸）】。由于酶的催化頻率很高，可放大反應的效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。當加入陽性標本（測定其中的抗體或抗原）后即與固相載體表面的抗原或抗體起反應而結(jié)合到固相載體上。如果需要可進一步對酶標抗體純化，以去除未結(jié)合的抗體。（參見酶聯(lián)免疫吸附試驗）【注意事項】該法可獲得高產(chǎn)量具有高度免疫活性和非特異性顯色低的標記物。加適量中性甘油后小量分裝，置－20℃～－30℃保存。加入待標記的抗體5～10mg， ，4℃過夜?！痉椒ú襟E】（改良過碘酸鹽氧化法）將HRP HAC－NaAC緩沖液中，滴入NaIO4 （此時酶的顏色應由黃變綠），4℃作用30min。HRP含有18％的碳水化合物，酶的糖鏈部分與酶的活性無關(guān)，用過碘酸鈉將酶表面糖分子的羥基氧化為醛基，醛基的化學性質(zhì)活潑，可與抗體分子的氨基結(jié)合，形成按克分子比例結(jié)合的酶標記物，然后用NaHB4還原即成酶標記的抗體。 （一）酶標抗體的制備【基本原理】 通過化學反應或免疫反應，使酶與抗體結(jié)合，其結(jié)合的產(chǎn)物為酶標抗體。酶免疫技術(shù)是目前主流的免疫學檢測技術(shù)，廣泛應用于醫(yī)學和生物學科的各個領(lǐng)域。顯色反應顯示了酶的存在，從而證明了相應免疫反應的發(fā)生。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學反應的~特異性，也不影響酶本身的酶學活性，即在相應而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而顯色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)和放射免疫技術(shù)，即經(jīng)典的三大標記技術(shù)。它可借助熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定，可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應進行定性和定位研究；或應用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。它的特點是具有高度的特異性和敏感性。補體的采集以20只以上家兔的血清混合為好，小量分裝，200C低溫或凍干保存。3．使用的補體應新鮮，活性高。表45 微量細胞毒試驗的判定標準死細胞（%） 計分 結(jié)果判斷死細胞（%） 計分 結(jié)果判斷010 1 陰性1120 2 微弱陽性2140 4 弱陽性 4180 6 陽性 81100 8 強陽性【注意事項】1．用于HLA分型的血液標本以玻璃珠脫纖維抗凝為好，詞法淋巴細胞獲得率高，血小板污染少，結(jié)果宜于觀察。6． 靜置，待細胞下沉后用低倍鏡倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果。5． 每孔加12%中性甲醛溶液8181。4． 每孔加5%伊紅Y水溶液3181。3． 每孔加兔補體5181。2． 每孔加2106/ml PBMC懸液1181。5．器材 導致相差顯微鏡或普通光學顯微鏡、水平離心機、冰箱、微量移液器等。3．補體 采用家兔新鮮混合血清。2．HLA分型板市售標準HLA分型反應板（Terasaki板），一般為72孔，從上至下分為112行，從左至右分為A、B、C、D、E、F 6列?！酒鞑脑噭? 1．待檢淋巴細胞懸液 取待檢者抗凝血10ml，采用淋巴細胞分離液分離PBMC，洗滌后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2106/ml。死亡細胞被染料著色。應用血清學方法鑒定的抗原稱為SD抗原，包括HLAA、B、C、DR和DQ抗原。若待檢淋巴細胞表面的HLA抗原與移植分型血清（抗體）一致，在補體作用下導致細胞毒作用。HLA分型的方法，主要有血清學分型法、細胞學分型法和基因分型法等技術(shù)。附 HLA血清學分型法人類白細胞抗原（HLA）是由HLA復合體編碼的一組抗原，具有高度的多態(tài)性，HLA不論在基礎(chǔ)免疫學，還是臨床醫(yī)學方面，均具有重要的研究價值。4．實驗用品要潔凈，試劑配制要準確，避免各種可能的干擾因素影響試驗結(jié)果。2．因有的豚鼠血清對小鼠淋巴細胞有天然毒性作用，故應篩選活性高、毒性低的新鮮豚鼠血清作為補體，對獲滿意結(jié)果至關(guān)重要。死細胞腫脹變大，呈暗紅色；活細胞形態(tài)正常，不著色，折光性強，有立體感。（3）% ml，混勻，立即滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，迅速鏡檢（要求在5min內(nèi)鏡檢完畢）。輕輕混勻后，置370C水浴30min。通常，1081108個細胞。（3）將上述細胞懸液移如試管，1 000 r/min，離心10 min 。（2）用解剖器械打開胸腔，取出胸腺，置含有4ml冷Hanks液的平皿內(nèi)。7．試管、吸管、載玻片等。5．含5%新生牛血清的冷Hanks液、%戊二醛。3．補體 豚鼠新鮮血清，經(jīng)小鼠胸腺細胞吸收后，用5%新生牛血清的冷Hanks液作1：3稀釋?！酒鞑脑噭?．動物 46周齡的健康小鼠。如在進行同種異體移植時，通過檢測淋巴細胞表面的HLA抗原或血清中抗HLA抗體，可用于HLA定型和HLA配型；也可用于已知抗T淋巴細胞血清，鑒定T細胞亞群；還可用于人的淋巴細胞作抗原，檢測抗淋巴細胞自身抗體。通過顯微鏡計數(shù)死細胞占總細胞數(shù)的比率，判斷細胞死亡率?！净驹怼繋в斜砻婵乖陌屑毎c其相應特異性抗體結(jié)合后，在補體存在的情況下，通過經(jīng)典途徑激活補體，導致靶細胞膜損傷，進而細胞裂解死亡，為補體依賴的細胞毒試驗。 3．補體性質(zhì)不穩(wěn)定，以試驗的當天采取效果最好，操作時盡量減少在室溫停留的時間?！咀⒁馐马棥?．以細菌作抗原時，應使用細菌的提取液而不用懸液，通過滴定找出最適稀釋度。然后判斷待檢血清是否為陽性反應。3．其他 補體（2個實用單位）、生理鹽水、小試管、吸管、37℃水浴箱。圖4－1 補體結(jié)合試驗示意圖【器材試劑】 1．抗原 用傷寒桿菌可溶性抗原、2%綿羊細胞懸液。因此作本試驗之前必須通過一系列預備試驗來確定補體、溶血素、抗原或抗體的使用量。本反應敏感性、特異性均較高，可用于檢測某些病毒病、立克次體病、梅毒病等。反之若出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，則為補體結(jié)合陰性，表示待檢的抗原抗體不對應或缺少一方，不能固定補體，游離補體被后加入的指示系統(tǒng)固定，導致綿羊紅細胞溶解。 三 補體結(jié)合試驗 【實驗原理】 補體結(jié)合試驗（plement fixation test）是一種有補體參與，并以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應。一般沒有必要進一步提純抗體，但在試驗前需先經(jīng)過56℃30min或60℃3min以滅活補體。所以檢測補體活性的血清標本和作為補體試劑的血清必須新鮮。必須保存時采用小量分裝的辦法，置－70℃下可保存數(shù)月，避免反復凍融。不溶血：呈紅細胞混懸液?！痉椒ú襟E】取小試管4支，分別注明管號，按下表依次將各成分加入試管中。補體（2個實用單位）?！酒鞑脑噭?%綿羊紅細胞懸液（SRBC）。 二 溶血試驗 【實驗原理】動物接受異種細胞注射而免疫，于血清中產(chǎn)生特異性抗體（即溶血素），此紅細胞與相應抗體特異性結(jié)合，在電解質(zhì)存在時能發(fā)生凝集，若再有補體參與，紅細胞則被溶解，稱溶血反應（hemolytic）。鈣、鎂離子的存在可穩(wěn)定溶血系統(tǒng)，但含量過多時，反而抑制溶血反應。紅細胞濃度增加一倍，可使50％溶血補體量增加25％左右。補體的溶血活性受多種因素的影響，如綿羊紅細胞濃度及溶血素的量等。試驗中吸取2％SRBC時注意不斷輕搖。實驗器材應清潔。在急性炎癥、感染、組織損傷（如風濕熱急性期、結(jié)節(jié)性動脈周圍炎、皮肌炎、傷寒、Reiter綜合征和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎）、腫瘤、骨髓瘤等時，?？梢娧a體含量升高，使CH50值偏高；低補體血癥多見于與免疫有關(guān)的疾病，系病程中免疫應答消耗了補體所致，如：急性腎小球腎炎、膜增生性腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動期、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。第10管為空白對照管，實驗正常，應不發(fā)生溶血。用721分光光度計在波長542nm讀T值。管號 1：20 血清mlBB液溶血ml（2U/ml）2%綿羊紅細胞ml 搖勻置37℃水浴箱內(nèi)30min，取出離心2500rpm5min觀察結(jié)果對應管50％溶血所示血清總補體活性（U/ml）120021333100480566．6657．1750844．494010－－取試管10支，分別編號到10，按表4－1加入物質(zhì)。制備50％溶血標準管 取2％SRBC懸液2ml加蒸餾水8ml，SRBC全部溶解，為100％全溶管。試管、空針、針頭、刻度吸管、離心機、721分光光度計（）、水浴箱等。溶血素（抗SRBC抗體） 按效價用BB液稀釋至2單位。比積SRBC用BB液配成2％細胞懸液。使用時用蒸餾水1:5稀釋。在50％溶血（CH50）時，其溶血的程度與補體量的關(guān)系最敏感，近似直線關(guān)系，故以50％溶血度作為反應的終點指標，所測補體量較為準確，由于綿羊紅細胞與溶血素結(jié)合激活補體是經(jīng)典C1途徑，所以此反應反映了總補體的活性。 實驗四 補體參與的反應 通過以下補體參與的各項實驗的操作，要掌握各項實驗的基本原理，熟悉操作步驟、結(jié)果判斷及注意事項；還要進一步增加對補體生物活性的感性認識， 一 血清總補體溶血活性（CH50）測定 【實驗原理】溶血素（抗綿羊紅細胞抗體）與綿羊紅細胞接觸后發(fā)生特異性結(jié)合，此時可激活補體（經(jīng)典途徑），從而使綿羊紅細胞溶解。 2．PEG的分子量不同，性質(zhì)亦有所區(qū)別；PEG溶液濃度不同所沉淀的免疫復合物也 不同，濃度越大沉淀的復合物越小。 4．本方法敏感度高于瓊脂單擴散試驗5～10倍，批內(nèi)、批間重復性較好，操作簡便快速，1h可出結(jié)果。 2．也可用分段直線計算法得到結(jié)果，舉例如下： 標準管序號 1 2 3 4 標準管IgG含量(g／L) 11. 0 標準管A值 血清管A值 以上例子中，血清管的A值位于標準管1和標準管3之間，計算如下： 3．正常血清IgG參考值 ～ g／L。各血清管的IgG含量可從標準曲線上查得。逐次測定 各標準管和血清管，準確讀取和記錄各自的A值。 4．抗原抗體反應 向各標準管和血清管中分別加入稀釋抗血清，混勻后至37℃水浴 30min。 2．血清管準備 將待檢血清和標準血清均做1∶10稀釋(+)，各取10μl分放于預先標記的試管中。取上述IgG標準液各10μl，分放于4個試管中；另取生理鹽水10μl，放于第5支試管中，作為空白對照。 3．器材 分光光度計(721或731等)、水浴箱、微量移液器、刻度吸管、試管等。12H2O 、NaH2PO4 【器材試劑】 1．標本 待檢人血清、標準血清(混合正常人新鮮血清)、人IgG標準品(或凍干人血清IgG參考標準)。因此可通過測定透射光衰減(以A值表示)或散射光強度來檢測抗原抗體反應，本試驗以常用透射比濁法檢測人血清